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目的:本研究通过对人结肠癌全外显子测序的生物信息学分析,预测新抗原,确定其所结合的MHC(人类为HLA)分子亲和力。体外模拟抗原提呈过程对肿瘤新生抗原肽进行免疫原性检测,阐述新抗原肽的免疫原性与其MHCⅠ类分子亲和力变化度及MHCⅠ等位基因型之间的关系。在此基础上形成快速发现有效新抗原的新方法。方法:1.采用NGS测序技术对患者肿瘤组织进行全外显子测序,获得肿瘤的全外显子基因组数据。2.通过Net-MHC4.0等软件预测(9肽)新抗原肽,确定其所结合的MHC I等位基因和分子亲和力。3.由生物公司根据新抗原多肽的氨基酸序列,合成新抗原多肽。4.体外诱导外周血单个核细胞(PBMC)分化为未成熟树突状细胞(im DC)。5.制备负载新抗原多肽的DC疫苗。6.进行DC疫苗与PBMC共培养。7.采用ELISPOT酶联斑点技术量化新抗原多肽的免疫原性。8.以流式细胞技术鉴定成熟树突状细胞(m DC)及最后共培养混合细胞中T、B、NK等各免疫细胞的百分比。结果:1.通过NGS测序技术及生物信息分析技术预测了共222种新抗原肽(来自6例结肠癌患者标本),明确了其等位基因及其MHC分子亲和力等信息。2.通过流式细胞分析技术证明成功制备92种负载新抗原多肽的DC疫苗,其中CD11c+、CD83+细胞占淋巴细胞群97.4%,CD80+、CD86+占淋巴细胞群97.4%。3.采用ELISPOT酶联斑点计数(T值)量化每种新抗原肽的免疫原性,将每个病人的T值进行标准化转化到同一量纲水平,Two-Way ANOVA分析结果:HLA亲和力变化度区间在1-4(Group B)标准化T值水平,明显高于≤1(Group A)标准化T值水平和>4(Group C)标准化T值水平,差异具有统计学意义(p<0.05),实验发现T值最高的新抗原的HLA亲和力变化度位于1-4之间。4.将每种肽的HLA-Ⅰ等位基因型进行分类,所结合新抗原肽数量最多的为HLA-Ⅰtype1,其次为HLA-Ⅰtype2,结合新抗原肽数量最少的为HLA-Ⅰtype3,Two-Way ANOVA分析结果:HLA-Ⅰtype1标准化T值水平,明显高于HLA-Ⅰtype2和HLA-Ⅰtype3标准化T值水平,差异具有统计学意义(p<0.05),实验发现T值最高的新抗原的HLA-Ⅰ等位基因型为HLA-Ⅰtype1。5.最终培养3周后的混合细胞做流式细胞分析显示:CD4+T细胞(CD3+CD4+)所占比例为37.41%,CD8+T细胞(CD3+CD8+)所占比例为16.67%,NK细胞(CD3-CD56+)所占比例为33.09%,B细胞(CD3-CD19+)所占比例为0.84%,表明新抗原肽不仅对CD8+T细胞具有增殖活化作用,同时对CD4+T细胞及NK细胞也有促进增殖作用。结论:1.HLA分子亲和力变化度位于1-4之间的新抗原的免疫活性相对更强。2.递呈新抗原种类最多的HLA-Ⅰ等位基因型,所递呈的新抗原的免疫活性相对更强。3.新抗原肽不止对CD8+T细胞具有增殖活化作用,同时对CD4+T细胞及NK细胞也有促进增殖作用。4.基于新抗原HLA分子亲和力变化度及HLA等位基因型可建立筛选免疫活性较强的新抗原的简捷的新方法。