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目的:顺铂是目前国内外应用最为广泛的抗癌药物之一,大剂量顺铂化疗对癌细胞杀伤快而强,但对机体造成的副作用大。肿瘤疫苗作为机体内在的一种新的治疗手段,主要依赖于激活机体自身的力量去杀伤瘤细胞,这种杀伤力是有限的,并且缓慢。肿瘤疫苗联合化疗,可降低化疗药的剂量,减轻毒副作用。本实验用小剂量顺铂与小鼠肝癌H22细胞分泌的exosomes瘤苗联合应用,评价联合应用的抗肿瘤效果,研究其可能机制。从而为临床开展化疗后的肿瘤疫苗主动免疫提供了实验依据。方法:1.以小鼠肝癌H22细胞为实验对象,研究顺铂在体外对H22细胞生长的抑制作用和顺铂对H22细胞Fas表达的影响:MTT法检测顺铂对H22细胞的增殖抑制率;RT-PCR和Western blot分别检测顺铂对H22细胞Fas的mRNA和蛋白表达水平的影响。2.采用超速分级离心和蔗糖密度梯度离心提取纯化exosomes瘤苗,以exosomes瘤苗免疫小鼠,RT-PCR检测exosomes瘤苗对小鼠脾淋巴细胞FasL表达的影响。3.体外观察exosomes诱导产生的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性及顺铂对CTL杀伤的增敏作用,应用Hoechest 33258染色、电镜观察H22细胞凋亡形态改变。4.建立BALB/C小鼠肝癌移植瘤模型,从以下几个方面观察顺铂与exosomes联合应用在体内对小鼠肿瘤生长的抑制作用:观察移植瘤小鼠生存时间;剥瘤后称重计算肿瘤抑制率;肿瘤组织行HE染色观察,超微结构行透射电镜观察。5.在BALB/C小鼠肝癌移植瘤模型上观察顺铂与exosomes瘤苗对荷瘤小鼠免疫功能的影响:称量各组小鼠胸腺和脾脏的重量,计算胸腺指数和脾脏指数;用MTT法检测BALB/c小鼠脾细胞增殖情况和细胞毒活性;ELISA法检测顺铂与exosomes瘤苗治疗后小鼠血清中IL-2,INF-γ水平。结果:1.MTT抑制率实验显示,顺铂在实验药物浓度下对小鼠肝癌H22细胞的生长均有抑制作用,其抑制作用随浓度的增加而增大,呈剂量-效应依赖性。选择抑制率低的浓度: 2.5μg/mL和5μg/mL顺铂作为后续实验浓度。RT-PCR和Western blot检测结果显示经2.5μg/mL和5μg/mL顺铂作用24 h后,H22细胞Fas mRNA水平分别升高3.1倍和4.9倍,Fas蛋白水平分别升高3.3倍和5.1倍。2.RT-PCR结果显示, exosomes免疫后的小鼠脾淋巴细胞中,能扩增出456 bp FasL的特异性目的条带,未免疫的对照组脾淋巴细胞未见扩增出FasL的目的基因条带。3.低浓度顺铂(2.5μg/mL)预处理24 h后的H22细胞对CTL反应敏感性增强,在效靶比为10∶1、20∶1、40∶1、80∶1时的杀伤率分别高于单独CTL组,顺铂增强了CTL的杀伤效应。Hoechest 33258染色和电镜结果显示H22细胞出现凋亡的形态学改变。4.顺铂联合exosomes瘤苗对移植瘤抑制作用最强,移植瘤质量为(1.03±0.14)g,抑瘤率为64.4%。HE染色可见联合治疗组肿瘤组织有大量淋巴细胞浸润;肿瘤组织超微结构透射电镜观察,联合治疗组除见到大量坏死细胞外,尚有凋亡细胞和凋亡小体的存在。5.联合治疗组与exosomes瘤苗组荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数明显高于对照组,单独顺铂对免疫器官影响不显著。顺铂化疗后联用Exosomes瘤苗,荷瘤鼠脾指数、胸腺指数分别为(9.96±0.91)mg/g和(3.51±4.79)mg/g,与对照组比较明显提高(P <0.01),且脾淋巴细胞增殖能力和细胞毒活性增强(P <0.01);顺铂+Exosomes联合治疗组小鼠血清中IL-2,INF-γ水平分别为(421.51±39.17) pg/mL和(39.86±3.15) pg/mL,与对照组相比差异有统计学意义(P <0.01)。结论:1.顺铂诱导小鼠肝癌H22细胞Fas表达上调,exosomes瘤苗能够显著增高小鼠脾淋巴细胞FasL表达水平,顺铂与exosomes联合治疗有协同抑制肿瘤的作用,产生协同作用的机制与增强CTL活性、诱导肿瘤细胞凋亡有关。2.动物实验证明,顺铂与exosomes联合治疗能够显著抑制体内移植瘤的生长,抑瘤率为64.4%。两者联合应用后,产生了协同抗肿瘤作用,这可能与增强抗肿瘤免疫功能有关。