论文部分内容阅读
背景创面的愈合是一直外科学研究的热点,在组织受到损伤后尽快地促进创面的修复是至关重要的,间充质干细胞治疗具有疗效高、毒性小、免疫原性低等优势,在治疗过程中,不易出现免疫排斥等不良反应,但间充质干细胞在还有着免疫排斥、致畸致瘤等并发症。与干细胞相比,干细胞源外泌体的治疗具有稳定性高,不易受损伤体内的微环境影响等优点,现已成为组织工程的研究热点。研究表明,外泌体中可影响Notch信号通路的调节。创面修复过程中多种细胞共同参与,炎症期中有巨噬细胞参与,修复期中成纤维细胞、血管内皮细胞等细胞参与。Notch信号通路在这些细胞的增殖分化中都有着调节作用。因而分离提纯骨髓间充质干细胞外泌体,探讨其对创面愈合的效果,并研究Notch信号通路在其中的表达情况为本研究的主要内容。目的骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stromal Cells,BMSCs）可以有效地促进创面愈合,然而直接将骨髓间充质干细胞用于治疗创面仍然有着许多潜在的风险,例如肿瘤的形成,血栓的形成和免疫排斥反应。故而使用骨髓间充质干细胞提取的外泌体进行治疗,是比较理想的选择。因此分离提纯骨髓间充质干细胞外泌体,探讨其对创面愈合的效果,并研究Notch信号通路在其中的表达情况成为本研究的主要内容。本研究通过SD大鼠骨髓间充质干细胞提取的外泌体注射于小鼠背部的创面,并与使用了Notch激活剂及Notch抑制剂+外泌体的治疗方法来进行对比,在体内研究Notch信号通路对创面愈合的作用。方法1.SD大鼠的骨髓间充质干细胞的提取鉴定及SD大鼠的骨髓间充质干细胞外泌体的分离与鉴定:用组织贴壁法培养收集SD大鼠的骨髓间充质干细胞。而后使用差速离心法处理细胞,分离外泌体。使用透射电镜观察SD大鼠骨髓间充质干细胞的外泌体的形态。用纳米颗粒跟踪分析仪鉴定外泌体的颗粒大小。用蛋白质印迹法（Western Blot,WB）鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞的外泌体中Notch通路中的特异性配体Jagged1的表达。2.SD大鼠骨髓间充质干细胞的外泌体对小鼠背部创面愈合中Notch信号通路的影响:建立直径为1cm的balb/c小鼠背部全层皮肤缺损创面模型,分为四组,每组9只,在受伤后的第1天在小鼠背部创面注射相应的药物,EX组（外泌体组）在创面周围注射200μg的骨髓间充质干细胞的外泌体,EDTA组（Notch激活剂组）在创面周围注射Notch激活剂EDTA,EX+DAPT组（外泌体+Notch抑制剂组）在创面周围注射200μg的骨髓间充质干细胞的外泌体及Notch抑制剂DAPT,NS组（生理盐水组）在创面周围注射200μl的生理盐水,分别在受伤后第3天,第7天,第14天观察并记录创面愈合情况。取受伤后第3天,第7天,第14天每组取3只小鼠,取背部创面组织,使用Western Blot检测创面组织中Notch通路的Notch1和Hes1的表达,使用HE染色检测创面组织中细胞的形态与分布。结果1.从SD大鼠骨髓中获取骨髓间充质干细胞后,培养骨髓间充质干细胞,可见SD大鼠骨髓间充质干细胞呈梭形,不规则生长。收集骨髓间充质干细胞培养上清液,提取外泌体。2.在透射电镜视野下观察SD大鼠骨髓间充质干细胞外泌体,可见外泌体样结构。3.使用NTA进行分析SD大鼠骨髓间充质干细胞外泌体的粒径、分布,测得平均粒径大小处于30-200nm的分布范围,符合外泌体的特征。4.对SD大鼠骨髓间充质干细胞外泌体进行蛋白质印迹检测,检测到Notch通路的配体Jagged1的存在,提示骨髓间充质干细胞外泌体中含有Notch信号通路的配体Jagged1。5.在小鼠的创面愈合实验中,EX组及EDTA组,均可促进创面愈合,且EX组的治疗效果优于EDTA组。与NS组相比,EX+DAPT组在创面愈合方面无明显差异。提示外泌体的可以促进创面愈合,激活Notch信号通路可以促进创面愈合,而使用外泌体的同时抑制Notch信号通路会使外泌体的治疗效果减弱。6.外泌体处理组Notch1和Hes1表达升高,外泌体+Notch抑制剂处理后表达最低。Notch激活剂处理后表达升高,但没有达到EX组的程度。7.在创面组织的HE染色中,第3天,四种不同方法的创面组织均有大量炎性细胞存在。第7天,EX组及EDTA组创面组织中新生肉芽组织明显,纤维结缔组织增生明显,提示其愈合速度较快。第14天,EX组及EDTA组创面切片中新生肉芽组织更加明显,纤维结缔组织增生更加明显,提示其愈合速度仍比对照组快。使用外泌体及激活Notch通路的小鼠创面愈合较快,且已出现新生的皮肤、毛发滤泡和脂肪细胞,而注射生理盐水和抑制Notch通路的无明显变化。结论1.使用外泌体处理后创面愈合速度加快,提示SD大鼠骨髓间充质干细胞的外泌体能够促进小鼠全层皮肤缺损创面的愈合。2.使用Notch抑制剂减弱了外泌体对Notch通路的作用后创面愈合减慢,SD大鼠骨髓间充质干细胞的外泌体能够促进小鼠全层皮肤缺损创面的机制可能与Notch通路的激活相关。3.外泌体处理后创面愈合速度最快,使用Notch抑制剂减弱了外泌体对Notch通路的作用后创面愈合减慢,但仅使用Notch激活剂处理后创面愈合稍快,没有达到使用外泌体的程度。提示Notch通路的激活可能是外泌体促进创面愈合的机制之一,但不是其唯一的机制。