结直肠癌是世界第三大恶性肿瘤，晚期结直肠癌无特效治疗，病死率高，目前化疗对于晚期结直肠癌效果不佳，因此患者预后较差。微小RNA参与调控细胞增殖、分化和凋亡的全过程，并且在多种癌症当中有表达异常，大量报道已证实微小 RNA在癌症发挥促进或抑制功能。microRNA-204（miR-204）位于 TRPM3基因的内含子，是miRNA家族的重要成员之一，在多种癌症当中起肿瘤抑制作用。结直肠癌组织中miR-204表达显著下调。可能是由于TRPM3/miR-204启动子在结直肠癌中常发生高甲基化而减少转录。miR-204-5p是 miR-204的成熟形式，恢复miR-204-5p能降低肿瘤恶性程度。如何有效在肿瘤组织中恢复miR-204功能是本研究关键所在。本研究研制叶酸（FA）官能化PLGA/ PLA纳米粒子（FA-NPs-miR-204）用以负载miR-204-5p并将其输送进入细胞，在细胞中释放其中的miR-204-5p，进而发挥抗癌功能。我们验证了该载药系统在结直肠癌细胞株和相应移植瘤中的作用，希望为探索结直肠癌治疗新方法提供一个思路。首先我们使用多功能单步表面官能化技术制备负载miR-204-5p的载药系统，即FA-NPs-miR-204，使用纳米粒度仪Malvern ZetasizerNano ZS90鉴定其粒径、电位以及对miR-204的包封效率，采用流式细胞术评估本系统的在结直肠癌细胞株HCT-116和HT-29中的转染效率，用FITC标记的FA-NPs-miR-204和空白对照处理上述细胞株，通过荧光显微镜检测细胞对FA-NPs-miR-204的摄取情况。我们还使用了TaqMan探针技术测定结肠癌HT-29细胞和HCT-116细胞内miR-204-5p水平。采用WST-1法检测实验细胞增殖能力，随后用倒置显微镜观察细胞集落形成。通过碘化丙啶、FITC-膜联蛋白V和DAPI多重染色检测结肠癌细胞株凋亡情况。采用表达荧光素酶的HT-29大肠癌细胞建立小鼠异种移植物模型，使用FA-NPs-miR-204治疗小鼠，并通过 IVIS系列临床前体内成像系统检测本载药系统在荷瘤小鼠体内的分布，采用DAPI和TUNEL双重染色来检测肿瘤组织的细胞凋亡。为了评估FA-NPs-miR-204载药系统的生物安全性使用血液分析仪和生化分析仪对小鼠进行血细胞计数及血液生化分析。动态光散射测量提示FA-NPs-miR-204平均流体直径约为232±7.4nm，多分散指数为0.257，zeta电位为-16.4±1.87mv，装载入纳米粒中的miR-204-5p的包封率为20.2±8.7％。FA-NPs-miR-204能有效被细胞摄取。使用荧光标记的FA-NPs-miR-204处理细胞后，发现细胞内存在强烈荧光，而细胞膜上仅有少数点状荧光，提示FA-NPs-miR-204能进入细胞内部。FA-NPs-miR-204成功在细胞内释放所负载的miR-204-5p，提高后者的细胞内浓度。与对照组相比，FA-NPs-miR-204使细胞内miR-204-5p增加超过800倍， FA-NPs-miR-204处理组细胞增殖能力和集落形成明显下降（P＜0.05）。在细胞凋亡实验中，用荧光显微镜可以观察到FA-NPs-miR-204处理组表现出比对照组明显更强的FITC-膜联蛋白V和碘化丙啶荧光信号。在体内实验中，用DiR染料标记的纳米颗粒（NPs-DiR和FA-NPs-DiR）经尾静脉注入小鼠移植瘤模型中，IVIS系列前临床体内成像系统提示我们的纳米载药系统在全身各脏器均有分布，肝脏最多。FA-NPs-DiR在肿瘤内的信号明显高于没有叶酸官能化的NPs-DiR，说明叶酸官能化后的纳米颗粒对肿瘤靶向性有所增强。用FA-NPs-miR-204以及其他对照组处理的 Luc-HT-29移植瘤模型中，FA-NPs-miR-204处理小鼠肿瘤无论是体积还是重量，都是各组中最小的，在对移植瘤组织切片进行TUNEL检测时，FA-NPs-miR-204组的切片中细胞凋亡也最为明显，证实 FA-NPs-miR-204确实在小鼠移植瘤模型内具有抑癌功能。此外，为了进一步评估用于临床的可行性，我们评估了该纳米载药系统的生物相容性。药物的毒副作用会严重限制药物在人体上的应用。向小鼠体内分别注射FA-NPs-miR-204和磷酸缓冲盐溶液，发现两组在血细胞计数和肝肾功能电解质分析方面没有显著差异，故可以认为FA-NPs-miR-204是安全的。综上所述，本研究构建了基于聚乙二醇化聚合物纳米粒子的新型miRNA转染载体PLGA-PLA-PEG-FA，其装载miRNA-204-5p后形成的FA-NPs-miR-204在体内和体外安全有效地抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。总之，本研究开发的聚合物纳米粒子转染系统FA-NPs-miR-204可以为探索结直肠癌新疗法提供思路。