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研究背景在青霉素治疗链球菌感染已经逐渐普及的当前,风湿性心脏病(rheum atic heart disease,RHD)仍保留较高的致死致残率,针对RHD的基础研究仍有重要意义。我们前面的研究通过对比多种RHD动物模型的构建方法,得到较稳定的RHD造模方式,并进行急性风湿性心瓣膜炎蛋白质组学的研究,创建了相应的差异蛋白表达谱。研究目的(1)进一步改良原有造模方法,来获得与人类慢性RHD病理表现更相似的动物模型。(2)进行慢性RHD大鼠二尖瓣组织的蛋白质组学研究,构建其差异蛋白表达谱,并在急性期和慢性期的差异蛋白间寻找异同和联系,为阐明RHD的发生发展机制和寻找新的干预措施提供依据。研究方法47只Lewis大鼠随机化分组——慢性RHD组(CRHD组)25只和正常对照组(Control组)22只。第1周,CRHD组于足垫皮下注射抗原Ⅰ(灭活GAS菌液+完全弗氏佐剂乳化剂)。给药间隔周期为7天,于第2周、3周、4周、5周腹部皮下注射抗原Ⅰ。Control组在同样时间点、同样剂量、同样部位注射无菌生理盐水+完全弗氏佐剂乳化剂。第6周开始,CRHD组予腹部皮下注射0.5ml抗原Ⅱ(灭活GAS菌液),给药间隔周期为7天,直至第28周,第29、30、31周停止抗原刺激,于第32周造模结束。Cont rol组在同样时间点、同样剂量、同样部位注射无菌生理盐水。造模结束后处死大鼠,大鼠血清进行ASO、CRP检测。大鼠心肌及二尖瓣行HE和Ma sson染色,并计算心肌炎、瓣膜炎发生率,对胶原纤维沉积进行定量。每组各随机抽取10例作为iTRAQ定量对象,余下6例作为蛋白验证实验对象。提取造模成功的慢性RHD大鼠二尖瓣组织蛋白,两组各10例二尖瓣瓣膜组织蛋白分别混合,进行iTRAQ定量2DLC-ESI-MS/MS分析。另外6例二尖瓣组织蛋白进行Western Blot蛋白定量分析,验证EMT/EndMT相关蛋白α-SMA、COL18A1及periostin。研究结果(1)造模过程中,CRHD组死亡3只,Control组死亡1只。(2)CRH D组和Control组第32周造模结束时,两组ASO及CRP均为阴性,检测值均数比较无统计学差异(p=0.054;p=0.156)。(3)HE染色结果示,CR HD组中有5只大鼠存在心肌炎症细胞浸润。16只大鼠二尖瓣瓣膜组织存在慢性淋巴细胞、浆细胞浸润,出现胶原蛋白增生、钙盐沉积及血管新生等现象。心肌炎比例占22.7%(5/22),瓣膜炎比例占72.7%(16/22);C ontrol组中1只心肌组织有散在的炎症细胞浸润,其二尖瓣瓣膜组织未发现炎症细胞浸润,其余Control组大鼠均未发现心肌组织或二尖瓣组织存在炎症细胞。Control组心肌炎比例占4.8%(1/21),瓣膜炎比例占0%(0/21)。(4)Masson染色结果示,Control组染色呈现淡蓝色,胶原纤维无明显增生现象;CRHD组染色明显加深,胶原纤维增生明显,排列紊乱。通过胶原沉积定量计算,与Control组相比,CRHD组胶原光密度明显增高,差异有统计学意义(p<0.01)。(5)鉴定所到蛋白质数量为2554,其中差异蛋白共167种(77种上调,90种下调)。(6)通过差异蛋白的pathway富集分析,发现在与EMT/EndMT相关的TGF-β信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路以及VEGF信号通路中,存在多种蛋白表达上调。(7)Western blot验证EMT/EndMT相关蛋白α-SMA、COL18A1及periostin,发现与Contr ol组相比,CRHD组上述三个蛋白表达增加,差异有统计学意义(p<0.05)。这一结果与iTRAQ结合2DLC-ESI-MS/MS定量蛋白组学分析结果趋势一致。研究结论通过延长抗原刺激时间,留白标本取材前的无抗原刺激时间,可以获得与人类慢性RHD病理表现更相似的慢性RHD大鼠模型;慢性RHD大鼠二尖瓣组织中,与EMT/End MT相关的蛋白alpha-SMA、COL18A1及periostin表达增高。EMT/EndMT可能参与RHD瓣膜病变的发生发展,阻断EMT/EndMT有望成为RHD新的治疗手段。