研究背景:近年来,随着对牙周膜干细胞(PDLSCs)研究的深入,相对于来源于牙周组织健康牙齿的健康PDLSCs(H-PDLSCs),从人牙周炎患牙处牙周组织中分离培养出的“炎症”PDLSCs(I-PDLSCs),因来源广泛、伦理学争议较小、易于患者接受等优点,逐渐受到科研工作者的重视。可惜的是,迄今为止,大量体外体内研究均表明,和H-PDLSCs相比,I-PDLSCs的部分生物学性能,特别是成骨分化能力明显受损,这在很大程度上限制了I-PDLSCs在细胞移植治疗中的应用潜能。同样地,本课题组已经通过对比同一患者来源I-PDLSCs和H-PDLSCs的生物学性能,进一步证实以上结果。因此,本研究拟采用两种PDLSCs间接或直接共培养的方式,探索适用于I-PDLSCs的临床应用策略:一方面,从I-PDLSCs和H-PDLSCs条件培养基(I-CM和H-CM)对两种PDLSCs生物学性能影响的角度出发,探讨是否可以通过改变I-PDLSCs的细胞培养微环境,进而改善I-PDLSCs受损的细胞性能;另一方面,将两种PDLSCs按照不同比例直接混合共培养后,通过观察混合细胞生物学性能的变化,分析是否可以将I-PDLSCs作为H-PDLSCs的辅助添加物,以弥补临床工作中H-PDLSCs来源受限的缺陷。研究方法:1、同一患者i-pdlscs和h-pdlscs的分离、培养和鉴定。为避免不同患者来源细胞之间复杂的免疫作用,本研究选择6组同一患者来源的i-pdlscs和h-pdlscs作为研究对象。同时,采用免疫荧光染色方法,分析两种pdlscs的表面标记物表达情况。2、同一患者i-pdlscs和h-pdlscs间接共培养体系中的相互作用。首先,分别收集同一患者来源i-pdlscs和h-pdlscs的体外培养上清液,并分别制作出“炎症”和健康条件培养基(i-cm和h-cm)及其相应的成脂和成骨诱导液。然后,观察细胞在体外培养时,两种cms对两种pdlscs克隆形成、增殖和成脂/成骨分化潜能的影响。本实验分为4组:h-pdlscs在健康条件培养基(h-cm)中培养(hc-hm);h-pdlscs在“炎症”条件培养基(i-cm)中培养(hc-im);i-pdlscs在健康条件培养基(h-cm)中培养(ic-hm);i-pdlscs在“炎症”条件培养基(i-cm)中培养(ic-im)。其中hc-hm作为阳性对照组;ic-im作为阴性对照组。3、同一患者i-pdlscs和h-pdlscs直接共培养体系中的相互作用。将来源于同一患者的i-pdlscs和h-pdlscs按照不同比例直接混合共培养,通过观察混合细胞整体的增殖、成骨分化、膜片形成能力以及膜片体内新骨形成能力,进一步分析两种pdlscs混合后,细胞生物学性能的变化情况。实验分为5组,其中75%i-pdlscs混合25%h-pdlscs共培养组(75%ic+25%hc),50%i-pdlscs混合50%h-pdlscs共培养组(50%ic+50%hc)和25%i-pdlscs混合75%h-pdlscs共培养组(25%ic+75%hc)为3个细胞共培养组。i-pdlscs单独培养组(100%ic)和h-pdlscs单独培养组(100%hc)分别为“炎症”和健康细胞对照组。4、统计学分析。本研究中的每个实验均设置了3个平行组并求平均值,以尽量减少人为操作所产生的误差。然后,采用spss18.0软件中的随机区组设计方差分析和tukey事后检验方法,对各样本所得平均值(6组)进行统计学分析。研究结果中所有计量资料均采用平均值±标准差的形式表示。p<0.05表示相应两组之间存在明显统计学差异。研究结果:1、第一部分显示,I-PDLSCs和H-PDLSCs均阳性表达间充质干细胞表面标记物(STRO-1、CD146、CD105和CD90),而阴性表达造血干细胞表面标记物(CD31和CD34)。2、第二部分显示,细胞体外培养时,尽管I-PDLSCs和H-PDLSCs在I-CM和H-CM培养微环境中的成脂分化潜能相似,但是,和H-CM相比,两种PDLSCs在I-CM体外培养微环境中的增殖能力明显增高,而成骨分化能力明显减弱。更重要的是,本研究表明,当I-PDLSCs的体外培养微环境更换为H-CM成骨诱导液时(IC-HM),其受损的成骨分化潜能可以得到一定程度的恢复。3、第三部分显示,I-PDLSCs和H-PDLSCs直接共培养时,两种细胞可以共存,且I-PDLSCs所占的百分比呈现逐渐升高的趋势。同时,相对于H-PDLSCs单独培养,添加的I-PDLSCs可以促进细胞的整体增殖速度。相对于I-PDLSCs单独培养,含有H-PDLSCs共培养组的成骨分化能力明显增高,而且在共培养体系中,只要H-PDLSCs的添加量达到50%以上,混合细胞整体的体外成骨能力和体内新骨再生潜能均接近于H-PDLSCs单独培养组。研究结论:1、从同一患者口内是可以同时分离培养出I-PDLSCs和H-PDLSCs,且其均具有间充质干细胞的典型表征,是深入研究I-PDLSCs的良好研究对象。2、同一患者来源的I-CM和H-CM存在差异,且通过改变I-PDLSCs的体外培养微环境(H-CM),可以在一定程度上恢复其受损的成骨分化潜能。3、在一些临床情况下,同一患者来源I-PDLSCs和H-PDLSCs直接共培养,可以作为一种简单有效的获得自体PDLSCs材料的方法,即当H-PDLSCs来源不足时,I-PDLSCs可以作为一种辅助的细胞来源,直接和H-PDLSCs混合后,应用于组织再生治疗;当H-PDLSCs来源充足时,添加少量的同一患者来源I-PDLSCs(低于总体的25%),可以在相对短的时间内得到更多的PDLSCs。