第一部分 人醛固酮瘤细胞原代培养方法的建立及细胞鉴定目的原发性醛固酮增多症是最常见的继发性高血压的原因。其中醛固酮瘤为第二常见的原发性醛固酮增多症亚型,早期手术治疗效果好。目前已发现醛固酮瘤体系的致病基因主要是KCNJ5、CACNA1D、ATP2B3和ATP1A1。国际上通常利用突变基因转染HEK293细胞系、H295R细胞系或HAC15细胞系的方法研究相应的基因功能,缺乏利用原代培养技术研究肿瘤发生、发展的研究。本研究拟建立醛固酮瘤的原代细胞培养方法并进行细胞鉴定,以进一步探索肿瘤致病机制、功能及治疗靶点等。方法1.取新鲜切除的人醛固酮瘤组织,用2%的I型胶原酶消化后种板。2.用倒置相差显微镜连续观察细胞形态。3.用放免法测定培养液中醛固酮浓度。4.用免疫荧光法检测细胞内醛固酮合成酶表达。5.观察醛固酮瘤细胞的分泌功能随时间变化情况。结果1.原代培养的醛固酮瘤细胞贴壁生长,细胞呈圆形、三角形、多边形。在体外环境中生长良好。2.原代培养第5天,培养液中醛固酮水平为1084.0 ±323.0 ng/dL,较肾上腺皮质无功能瘤及皮质醇瘤显著升高。3.醛固酮瘤细胞中有醛固酮合成酶的免疫荧光表达。4.醛固酮瘤细胞培养第1天时分泌的醛固酮浓度最高,此后逐渐减弱,在第3天至第7天细胞分泌功能基本不变。结论本研究在国内首次成功建立醛固酮瘤的原代培养方法并进行了细胞鉴定,这有利于今后对醛固酮瘤的发病机制及功能的研究。第二部分钙通道阻滞剂及主要调节醛固酮分泌的因素对醛固酮瘤细胞分泌功能的影响目的醛固酮瘤的致病基因主要包括KCNJ5、ATP2B3、ATP1A1和CACNA1D基因。KCNJ5基因突变最为常见,存在于35-70%的醛固酮瘤中。这些基因突变后均能使醛固酮瘤细胞上的电压门控钙通道开放,钙内流增加,钙信号激活,从而促进醛固酮合成增加。在转染这些基因突变体的细胞中,已经观察到钙通道阻滞剂(CCB)能减少醛固酮分泌,但在最符合人体病理生理状态的人醛固酮瘤细胞中,CCB的作用如何却不甚清楚,其他主要调节醛固酮分泌的因素对醛固酮瘤细胞的分泌功能影响也未阐明。本部分的研究目的即是探讨CCB对醛固酮瘤细胞分泌醛固酮的影响,并比较不同类型CCB的作用的区别。同时,观察主要的醛固酮刺激因素,包括高钾、血管紧张素II、促肾上腺皮质激素和高钠,对醛固酮瘤细胞分泌功能及细胞增殖的影响。方法1.采用第一部分研究建立的原代培养方法培养醛固酮瘤细胞,共成功培养23例醛固酮瘤的细胞用于下述实验。2.培养细胞分组:对照组、L/T双通道CCB贝尼地平组(10μM)、L型CCB硝苯地平组(10μM)和T型CCB米贝地尔组(1OμM),处理细胞48h后收集培养液测醛固酮,收集细胞提取总RNA,逆转录成cDNA后行qPCR,检测CYP11B2 mRNA的表达量。3.培养细胞分组:对照组、高钾组(15mM)、血管紧张素II(100nM)和促肾上腺皮质激素组(1OOnM),处理24h后,收集培养液检测醛固酮水平,然后加入100μl培养基及10μlCCK-8,检测活细胞数量。4.培养细胞分组:不同钠浓度处理组(135、145、155、165、185mM),处理细胞24h后,收集培养液检测醛固酮水平,然后加入100μl培养基及10μl CCK-8,检测活细胞数量。5.Sanger测序法检测这23个醛固酮瘤组织的体系突变。结果1.贝尼地平、米贝地尔和硝苯地平均能显著抑制醛固酮瘤细胞的醛固酮分泌,三者的平均抑制率分别为25.5%、9.5%和17.8%。2.贝尼地平、米贝地尔和硝苯地平均能显著抑制醛固酮瘤细胞的醛固酮合成酶CYP11B2mRNA表达,其中贝尼地平的作用最强。3.促肾上腺皮质激素能显著刺激KCNJ5突变的细胞的醛固酮分泌(较对照组增加101.0±55.9%)以及细胞增殖。4.血管紧张素Ⅱ能显著促进KCNJ5突变的醛固酮瘤细胞分泌醛固酮(较对照组增加32.8±46.0%),但对细胞增殖无影响。5.促肾上腺皮质激素组醛固酮水平及细胞增殖数较高钾组及血管紧张素Ⅱ组显著升高。6.高钾对KCNJ5突变的醛固酮瘤细胞分泌醛固酮的功能及增殖均无影响。7.高钠刺激KCNJ5突变的醛固酮瘤细胞分泌醛固酮,但不影响细胞增殖。8.用于CCB处理实验中的16例醛固酮瘤组织中有14例检测出KCNJ5基因突变,在高钾、血管紧张素Ⅱ、促肾上腺皮质激素和高钠处理实验中的7例醛固酮瘤组织中均检测出KCNJ5基因突变。结论1.贝尼地平、米贝地尔、硝苯地平不仅能显著抑制醛固酮瘤细胞的醛固酮水平,还能显著抑制醛固酮瘤细胞CYP11B2mRNA的表达。2.ACTH是促进KCNJ5突变的醛固酮瘤细胞增殖及分泌醛固酮的强有力的刺激。ATⅡ能刺激其分泌醛固酮,但作用较ACTH弱。3.首次发现高钠能促进KCNJ5突变的醛固酮瘤细胞分泌醛固酮,而高钾不能刺激其分泌。4.此部分23例醛固酮瘤组织有21例均检测到KCNJ5基因突变。在本研究的醛固酮瘤患者中(伴有高血压及低钾血症),KCNJ5体系突变的检出率高达91.3%。第三部分硝苯地平对人醛固酮瘤细胞转录组的影响及qPCR验证目的钙信号对正常情况下醛固酮合成的重要作用在多年前就已明确,但钙离子下游的信号通路并不清楚。随着醛固酮瘤的体系突变得到公认,KCNJ5、CACNA1D、ATP2B3和ATP1A1这四个突变基因激活的细胞内的钙信号也是其重要的致病机制,其钙离子下游的信号通路也不清楚。转录组学能高通量的检测某个时间的所有转录本,也可能发现新的转录序列。本研究拟观察硝苯地平处理对醛固酮瘤细胞的转录组的影响。方法1.体外原代培养醛固酮瘤细胞。2.分成两组:对照组和50μM硝苯地平处理组,处理48h。3.收集培养液测醛固酮水平,收集细胞RNA行转录组测序。4.选取对照组与硝苯地平处理组之间的差异基因,对部分有意义的基因行qPCR验证。结果1.共有2例患者完成了转录组学这部分实验。2例患者存在同样的KCNJ5基因的氨基酸改变,即p.G151R。2.比较对照组与硝苯地平处理组的转录组的结果,发现40个表达量丰富且有显著表达差异的基因。除了参与醛固酮合成的基因外,其他主要包括多个参与合成胆固醇及萜类化合物骨架的酶的基因,如HMGCR、HMGCS1、NSDHL、ACAT2、SDLE 等,log2FC 在-1.5 至-2.5 之间。Real-TimePCR 验证结果显示,HMGCS1的表达量在硝苯地平处理组显著降低,但NSDHL、SDLE、ACAT2的表达量在硝苯地平组较对照组无显著差异。结论1.比较对照组与硝苯地平处理组转录组的结果发现,醛固酮瘤细胞出现40个表达量高且有表达差异的基因。2.首次发现硝苯地平能抑制HMGCS1的表达。3.首次发现APA细胞表达多种合成胆固醇的基因。第四部分贝尼地平和硝苯地平对原醛患者醛固酮水平影响目的本研究组的工作证实在原代培养中,钙通道阻滞剂能显著抑制醛固酮的合成,且贝尼地平较硝苯地平有更强的抑制趋势。钙通道阻滞剂对醛固酮分泌的影响的临床研究少,且无贝尼地平在原醛患者中的临床研究,本部分拟研究L/T型钙通道阻滞剂和L型钙通道阻滞剂对原醛患者血浆醛固酮水平的影响。方法1.研究对象包括:特发性醛固酮增多症患者2例、醛固酮瘤患者11例、家族性原醛症-Ⅲ型(FH-Ⅲ)1例。2.停用影响醛固酮肾素活性比值的药物,服用哌唑嗪降压治疗,服用氯化钾补钾治疗。3.测定患者不服药日、口服1OmgL型钙通道阻滞剂硝苯地平日、口服8mgL/T型钙通道阻滞剂贝尼地平日的8点(服药前)、10点(服药后2h)的外周血醛固酮、肾素活性、皮质醇、血钾、血钠等生化水平。试验过程一直保持坐位,每隔15min测定血压一次。4.对有肿瘤组织标本的患者测定醛固酮瘤体系热点突变。结果1.贝尼地平能显著降低醛固酮水平,硝苯地平对醛固酮水平无显著影响。2.贝尼地平、硝苯地平均能显著降低原醛患者的血压水平。3.8例手术的原醛患者均存在KCNJ5基因突变,分别为p.E145Q(N=3)、p.G151R(N=2)、p.L168R(N=2)、p.I157_E159del(N=1)。结论首次观察了贝尼地平对原醛症患者血浆醛固酮水平的影响。单次口服8mg贝尼地平能显著降低醛固酮水平,单次口服10mg硝苯地平对醛固酮水平无显著影响。因此,贝尼地平用于原醛患者的降压治疗的同时有望降低患者的醛固酮水平。第五部分64例Gitelman综合征患者表型和基因型分析目的总结Gitelman综合征的临床及基因特点,提高对该病的认识和诊治。方法回顾性分析了北京协和医院2012至2016年诊断的64例Gitelman综合征患者的临床和基因特点。结果1.64例患者中男性患者39例,女性患者25例。初诊时年龄(35± 14)岁,血钾(2.86±0.44)mmol/L,同步 24 h 尿钾(82.27 ± 39.73)mmol/d,血镁(0.62±0.14)mmol/L,24h 尿钙(0.94±0.83)mmol/d,平均血压为 110/69mmHg。2.64例患者的基因突变散在分布于SLC12A3基因,40例患者为复合杂合突变,10例患者为单杂合突变,9例患者为多杂合突变,5例患者为纯合突变;复合杂合突变者初诊时血钾水平较高(P<0.05)。3.64例患者共检出74种不同的突变类型,32%的位点为新发突变(24/74)。p.Asp486Asn是最常见的突变位点,见于25%(16/64)的患者。结论Gitelman综合征患者的基因型和表型异质性很大,复合杂合突变患者的临床表型相对较轻。p.Asp486Asn是本研究中的热点突变。