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大黄鱼是优质的动物蛋白来源,其蛋白及水分含量较高,在贮藏过程中极易发生腐败。低温对水产品货架期具有至关重要的作用,它是限制微生物生长的重要因子。随着冷链物流的不断发展,水产品的冷链运输已经实现,但同时,耐冷菌的致腐作用也逐渐凸显。由于耐冷菌在低温时依然可保持较高的生长速率,因而能够成为水产品中的优势菌。研究表明,波罗的海希瓦氏菌(Shewanella baltica)为冷藏大黄鱼中特定腐败菌(Specific spoilage organism,SSO),作为一种典型的耐冷菌,对其适冷机制与致腐能力间的相关性研究,对冷藏大黄鱼的抑菌防腐具有重要意义。鉴于此,本研究以冷藏大黄鱼中分离鉴定的特定腐败菌S.baltica为研究对象,从适冷性及致腐能力分析入手,筛选在适冷及腐败表型上具有代表性的菌株;对不同培养温度下的菌株进行差异蛋白组学分析,筛选与不饱和脂肪酸(Unsaturated fatty acids,UFA)合成密切相关的差异蛋白;对关键的调控蛋白进行体内过表达,探究S.baltica的适冷机制与致腐性的关系,旨在为冷藏大黄鱼的保鲜抑菌提供新的研究思路及切入点。主要结果如下:测定8株不同S.baltica在4℃无菌鱼汁中挥发性盐基氮(TVB-N)及三甲胺(TMA)的产量,发现接种不同菌株的鱼汁中TVB-N及TMA的积累有明显差异,结合TVB-N及TMA产量因子的结果表明:不同菌株的致腐能力有显著差异,其中,S.baltica12及73分别为致腐能力最弱和最强的菌株。利用荧光偏振及气相色谱-质谱联用(GC-MS)分别测定了8株S.baltica在4℃及30 ℃下的膜流动性差异及脂肪酸组成差异,研究发现,S.baltica 12在4 ℃时的荧光各向异性是其在30 ℃膜流动性1.42倍,而S.baltica 73在4 ℃时的荧光各向异性与30℃基本持平。对比不同菌株的变化幅度,12号菌株的变化量最大,而73号菌株的变化量最小,且较其他菌株均有显著性差异(P<0.05),同样,平均微粘度的结果中我们也能看到一致的变化趋势;对细胞膜脂肪酸不饱和度的分析发现,S.baltica 73的不饱和脂肪酸含量提高了 12%,而S.baltica 12仅升高了 2%,其中在UFA中占比最高的棕榈一烯酸(C16:1)的含量也分别提高了 17%和7%,这个结果与流动性的结果一致。结果表明,S.baltica 73的适冷能力最强,而S.baltica 12的适冷能力最弱。综合以上结果推测,在8株S.baltica的实验菌株中适冷性及腐败能力呈正相关关系。不同培养温度下菌株的差异蛋白组学分析显示,4℃培养条件下的菌株较30℃的蛋白表达差异较大,TMT共鉴定得到651种差异蛋白,其中,上调蛋白262种,下调蛋白389种,分别影响S.baltica核酸代谢、氨基酸代谢、鞭毛组装、细菌趋化等多条代谢通路;参与了生物代谢、细胞生长、生物调节等多个生物进程;承担了核酸结合、催化活性等分子功能。多种UFA合成相关蛋白如含铁去饱和酶Des、3-羟烷基-ACP脱水酶FabA的均显著上调,促进S.baltica中UFA的合成,提高了S.baltica的细胞膜流动性,从而促进其对低温的适应性。脂肪酸降解阻遏蛋白FadR显著上调了 1.5倍而脂肪酸合成阻遏蛋白FabR显著下调了 0.62倍,他们是UFA合成中重要的调控蛋白。而三甲胺合成相关的蛋白没有显著变化。荧光定量PCR的结果显示,UFA与TMA合成相关基因的表达量与蛋白组学相应蛋白的定量鉴定结果一致,表明蛋白组结果较为可靠。构建了S.baltica 12,73的FabR及FadR过表达菌株,分别对各过表达菌株的腐败表型及适冷表型进行检测,比较了 4℃培养条件下野生株与过表达菌株的产TVB-N能力、产TMA能力、细胞膜流动性及脂肪酸组成的差异。研究发现,在FabR的过表达菌株中,其产TVB-N、TMA的能力以及膜流动性及不饱和脂肪酸的含量较野生株均显著下降,表明FabR在菌株致腐能力及适冷性中起负调控作用;在FadR的过表达菌株中,腐败及适冷表型均显著上调,表明FadR在菌株致腐能力及适冷性中起正调控作用。荧光定量PCR测定结果显示,FabR及FadR对TMA及UFA合成相关基因的调节分别起抑制与促进的作用,与表型结果一致;其中TMA合成相关基因的变化幅度较小,可能由于FabR及FadR并不直接调控TMA合成相关基因的表达,而是通过改变膜流动性来影响细胞的物质交换速率进而抑制或促进了腐败基因的表达以及表型的变化。综上所述,在S.baltica实验菌株中,其适冷性与腐败能力呈正相关关系。FadR对其适冷性起正调控作用,在4 ℃条件下,FadR可促进UFA合成酶Des及FabA的表达来增加细胞膜流动性,并提高菌株的致腐性;FabR对适冷性起负调控作用,它的表达会抑制UFA合成酶的表达,使细胞膜流动性减弱,同时降低菌株的致腐能力。在4℃下,S.baltica分别通过上调和下调不饱和脂肪酸合成通路调节因子FadR,FabR的表达来共同促进细胞适冷性从而提高其致腐能力。