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研究目的研究发现趋化因子及趋化因子受体诱导免疫细胞向移植物迁移在急性移植排斥反应中具有重要作用,因而靶向性阻断趋化因子及其受体之间的相互作用成为干预急性移植排斥反应的重要策略。CCR9是一种趋化因子受体,与其唯一配体CCL25结合后参与机体多种生理病理过程。但CCR9在移植领域的研究目前尚未见报道,因而本课题拟以小鼠皮肤移植为模型检测CCR9/CCL25在急性排斥反应中作用；并通过尾静脉输注Anti-CCL25中和抗体阻断CCR9-CCL25目互作用,观察其对移植物生存时间的影响,探讨该效应的作用机制,为临床治疗移植排斥反应提供一定的实验依据。研究方法1.以BALB/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者进行异基因皮肤移植。移植后不同时间点取移植组受者小鼠移植皮片、脾脏和外周淋巴结。HE检测移植皮片炎症反应程度；WB、免疫组化和激光共聚焦检测移植皮片中CCL25(?)CCR9的表达水平及细胞定位；流式细胞术检测外周淋巴结及脾脏中CCR9分子表达水平。2.异基因皮肤移植术后受者小鼠给予尾静脉注射Anti-CCL25中和抗体或IgG同型对照抗体处理,观察小鼠移植物存活时间,并检测各处理组移植皮片炎症反应情况。3.取中和抗体组及同型对照组受者小鼠移植皮片及脾脏,Western blotting检测移植皮片中CCR9表达水平；流式细胞术检测受者脾脏T细胞中CCR9表达水平及细胞表型；混合淋巴细胞培养及趋化实验检测各组脾脏T细胞增殖功能与趋化功能；ELISA检测分泌细胞因子能力(IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ),进一步探讨CCR9/CCL25途径参与小鼠皮肤移植急性排斥反应的作用机制。研究结果1.CCR9/CCL25途径参与小鼠异基因皮肤移植急性排斥反应我们成功建立了小鼠异基因及同系皮肤移植模型,HE染色显示异基因移植小鼠皮片中存在广泛的炎性细胞浸润；Western blotting、共聚焦及免疫组化检测观察到异基因移植组受者小鼠脾脏及移植皮片高表达CCR9蛋白且主要表达于CD3+T细胞表面,移植皮片中CCL25表达也明显高于同系移植组；流式细胞术结果提示,与同系移植组相比,异基因移植组小鼠脾脏中CCR9+T细胞比例在移植后各个时间点均显著增加,且以CD8+CCR9+T细胞增加为主,然而外周淋巴结中CCR9+T细胞数量无明显差异。2. Anti-CCL25中和抗体阻断CCR9/CCL25途径可延长移植物存活时间异基因皮肤移植后给予受者小鼠尾静脉注射Anti-CCL25中和抗体可明显延长移植物存活时间(13士3.13天vs7.4±1.74天),并降低移植皮片中炎症反应。3. Anti-CCL25中和抗体可降低脾脏及移植皮片中CCR9表达水平我们用流式细胞术检测了不同处理组受者小鼠脾脏细胞中CCR9表达,结果显示Anti-CCL25抗体可降低异基因皮肤移植受者小鼠脾脏中CCR9+T细胞数量,尤其是降低CCR9+CD8+T细胞比例；同时中和抗体注射组移植皮片中CCR9表达水平较同型对照组也明显下降。4. Anti-CCL25中和抗体抑制脾脏T细胞增殖与趋化功能,并抑制Thl型细胞因子分泌我们使用尼龙棉柱纯化得到不同处理组受者小鼠脾脏T细胞,经混合淋巴细胞实验检测发现,异基因皮肤移植后给予IgG同型对照处理组小鼠脾脏T细胞增殖能力明显增高,趋化实验证实其趋化能力也显著增强；而Anti-CCL25中和抗体注射则可明显抑制小鼠脾脏T细胞增殖和趋化能力。我们同时收集混合淋巴细胞培养上清经ELISA检测显示,中和抗体组培养上清中IFN-y水平较同型对照组明显下降,IL-12也有不同程度的降低,而IL-4、IL-10水平无显著改变。结论1. CCR9/CCL25途径参与小鼠皮肤移植急性排斥反应。2.给予(?)(?)nti-CCL25中和抗体注射可明显延长皮肤移植物存活时间。3. Anti-CCL25抗体延长移植物存活时间的可能机制是：降低受者小鼠脾脏CCR9+CD8+T细胞数量,抑制脾脏T细胞趋化及增殖功能,并减少IFN-γ分泌而发挥作用。