甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是世界上第三大油料作物,同时,油菜花期长、花鲜艳,具有较好的观赏价值。传统油菜品种一般为鲜黄色花瓣,花色单一,不能满足开发油菜花色观赏旅游的需求。研究人员在油菜育种过程中陆续发现一些花色突变体,如金黄、乳黄、柠檬黄、桔红、白、乳白、黄白嵌合体和微紫丝白花等,如果能利用这些突变体培育出稳定遗传且不影响产量的多彩油菜花新品种,将有效提升油菜观光旅游的价值,提高油菜产区农民的收入。然而目前未见油菜花色基因鉴定及其功能分析的研究报道。本研究通过对橘红花色品系R03与黄色花品系ZS11材料进行转录组测序分析,筛选到13个与花青素代谢途径相关的候选基因;对其中7个候选基因进行同源克隆,并对克隆所得序列进行生物信息学分析;最终构建了这些候选基因的6个超量表达载体,通过瞬时表达烟草叶片与转化拟南芥植株验证候选基因的基本生物学功能。主要研究结果如下:1.橘红/黄色花品系甘蓝型油菜转录组学分析对橘红花品系R03与黄色花品系ZS11材料变色前(S1)与变色后(S2)两个时期的花瓣进行转录组测序。在阈值参数P-value≤0.001、差异倍数|log2(FoldChange)|≥8和错误发现率FDR≤0.001的条件下,在R03-S1与ZS11-S1、R03-S2与ZS11-S2之间分别得到1368、1235个差异表达基因(DEGs),其共有DEGs为476个。分别对这三部分DEGs进行GO富集分析,DEGs均被富集到结合、细胞、细胞组分、细胞过程、代谢过程等。进一步对这些DEGs进行topGO富集分析,在“分子功能”注释中,均富集到了与花青素合成相关的条目,分别有原花青素生物合成过程、含花青素的复合生物合成过程、苯丙烷生物合成过程、类黄酮生物合成过程、含花青素的复合代谢过程、矢车菊素3-O-葡萄糖苷代谢过程等。在KEGG富集分析中,2127个DEGs中只有789个基因有注释条目,富集结果显示,这些DEGs被显著富集到苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成等代谢通路。根据拟南芥花青素生物合成途径中的关键结构基因、转录因子和转运蛋白基因序列,通过共线性分析,在甘蓝型油菜中共鉴定出133个与花青素生物合成相关的基因,包括69个结构基因、55个调节基因和9个编码转运蛋白的基因。进一步结合转录组分析结果,筛选出13个与花青素生物合成相关的关键基因,包括9个结构基因(BnC4H_A4、BnDFR_A9、BnDFR_C9、BnANS_A1、BnANS_C1、BnANS_A3、BnANS_C7、BnUGT79B1_A10、BnUGT79B1_C9)、3个调节基因(BnPAP1_A7、BnTT8_A9、BnMYBL2_C6)、1个转运蛋白基因(BnTT19_C9),且均在橘红色材料R03中有较高表达水平。对候选基因进行qRT-PCR验证,结果与转录组数据表达模式基本一致。2.候选基因的序列分析选取13个候选基因中的7个基因(BnDFR_A9、BnDFR_C9、BnANS_A1、BnANS_C1、BnANS_A3、BnANS_C7、BnPAP1_A7),对其CDS序列进行了同源序列克隆,在橘红色品系R03材料中依次得到1、1、1、3、2、1、1个拷贝,在黄色花品系ZS11材料中依次得到1、1、1、1、2、1、1个拷贝;同源序列比对结果显示,在橘红花色品系材料R03和黄色花品系ZS11间,BnDFR_A9、BnDFR_C9、BnANS_C1、BnANS_C7和BnPAP1_A7经克隆所得序列无差异,而BnANS_A1和BnANS_A3所得序列存在稳定差异。3.候选基因的功能分析对橘红花品系材料R03中克隆的基因,成功构建了6个超量表达载体pEarlygate101-BnANS_A1,pEarlygate101-BnANS_A3_R03.1,pEarlygate101-BnANS_C1_R03.1,pEarlygate101-BnANS_C1_R03.2,pEarlygate101-BnANS_C7和pEarlygate101-BnPAP1_A7。将这6个超量表达载体在烟草叶片中进行了亚细胞定位,其中BnANS_A1、BnANS_A3_R03.1、BnPAP1_A7编码的蛋白只在细胞核中表达;BnANS_C1_R03.1和BnANS_C1_R03.2编码的蛋白,在细胞质和细胞核中均有表达,且细胞核中的信号明显强于细胞质中的;由BnANS_C7编码的蛋白,只在细胞膜中有表达。将成功构建的6个超量表达载体,通过农杆菌介导的注射法在烟草叶片中瞬时表达,均未观察到花青素的积累。进一步通过花序侵染法遗传转化拟南芥,成功获得BnANS_A1、BnANS_A3_R03.1、BnANS_C1_R03.1、BnANS_C1_R03.2、BnANS_C7和BnPAP1_A7的T1代拟南芥转基因种子,后续研究将观察这些转基因材料的花瓣色泽变化。