多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)是重症监护病房(intensive care unit, ICU)患者发病和死亡的一个重要原因。MODS的成年患者在ICU中的发生率为11%～40%,在我国归因于MODS的总死亡率超过了60%。目前对于MODS的共识认为它是一种连续的生理紊乱状态,但对于这种状态的发病机制尚未完全明了。现有观点认为MODS与炎症反应、自由基生成增加和肠道菌群移位等有关。缺血再灌注损伤和严重脓毒症是MODS最常见的致病原因之一。MODS的治疗主要集中在支持性治疗,如增加氧输送,营养支持等。开发一种以减少氧化应激和调节炎症反应为靶点的药物可能是一种具有前景的研究方向。虎杖苷(3,4’,5-三羟基芪-3-葡萄糖甙,Polydatin,PD)是单晶体药物,它是从中国传统中药虎杖分离出来的(图1)。我们实验组以往工作表明,在严重失血性休克大鼠模型中,PD能通过减少大鼠动脉血管平滑肌细胞和神经元线粒体损伤发挥作用,这些作用与减少机体氧化应激水平有关。本实验拟通过复制大鼠失血性休克和盲肠结扎穿刺(cecal ligation puncture, CLP)二次打击模型,研究PD是否具有治疗MODS大鼠的作用以及它作用的可能机制。本研究主要分为两个步骤进行：1.MODS模型复制和PD最佳给药剂量探索；2.PD作用于MODS大鼠的机制探讨。第一部分MODS模型复制和PD最佳给药剂量探索方法：实验分为正常对照组(sham组)、MODS后生理盐水组(normal saline,NS)组和MODS后PD给药组,其中PD组又分为不同的给药剂量组(15mg/kg,30mg/kg,45mg/kg,60mg/kg大鼠体重)。sham组大鼠仅行基本外科操作,其余组大鼠在以上外科操作基础上进行失血性休克和CLP双重打击,随后立即进行给药(图2)。NS组给药为0.3mlNS×3次(CLP操作完成后立即开始,之后每6小时1次),PD组给药为不同剂量的PD溶解于0.3mlNS中通过股静脉10分钟内缓慢推注。建模治疗后各组大鼠(每组8只)撤管并缝合伤口,回笼,室温下自由饮食饮水。观察各组生存时间(每小时观察1次,以72小时为观察终点),计算各组72小时的生存率。为评估MODS诱导24小时后大鼠造模是否成功,抽取静脉血测定血清生化指标(BUN,CR-MB,TBIL,LDH,CK,ALT and AST)和动脉血气。随后立即颈椎脱臼法处死大鼠,常规固定肾、肺和肝组织,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色行病理分析。采用SPSS13.0软件录入数据,Kaplan-meier法进行各组生存时间分析,One-way ANOVA方法比较各组平均数±标准差,LSD-t法检验多重样本均数。1.各组给药后生存时间观察和最佳PD给药剂量sham组8只大鼠在24h、36h和48h三个观察时间点均存活。MODS处理的各组均有大鼠死亡。其中MODS+NS组前36小时仅有2只大鼠存活,48小时内全部死亡,72h观察时间段的中位数生存时间是29h。MODS+PD各给药组中PD45mg/kg组效果最优,8只大鼠在前36小时均存活,48小时时间内仅有1只死亡,72小时的中位数生存时间为49小时。由此初步确立PD45作为以后的给药剂量。2.生化指标测定和血气分析和sham相比,MODS+NS组大鼠血生化值均显著增高且两组间比较差别具有统计学意义(P<0.05).MODS+NS组的血气参数,包括pH值、血乳酸、碱剩余和HC03-均较sham组均有增高且两组间差值具有统计学意义(P<0.05)。同时PD各给药组中45mg/Kg组对于MODS各脏器的生化指标和血气分析改善作用最佳且明显优于MODS+NS组。3.病理鉴定sham组大鼠各脏器均未出现明显病理变化。然而,在MODS+NS组中,肾、肝和肺的病理均出现了病变。部分近端肾小管上皮细胞出现浊肿、变性、细胞部分缺失、管腔狭窄,有的管腔伴有少量血栓沉积；部分肝中央静脉缩小,肝窦扩张充血,肝细胞胞浆呈混浊肿胀,许多肝细胞出现气球样变或退行性变；肺间质水肿和扩大,部分肺泡萎陷,血管和间质周围有许多炎症细胞浸润。PD45mg/Kg给药组均有病变减轻。结论1.大鼠MODS模型诱导24小时后,肝脏、肾脏、心脏、肺脏功能均出现了损伤,肝、肾和肺的病理学结果支持了功能学的变化。2.以血生化指标增高倍数和病理的结果作为判定标准,大鼠MODS建模24小时后NS组肝脏和肾脏的功能出现了衰竭,说明MODS模型复制成功。3.结合MODS发生率、中位数生存时间、生化和血气指标的测定,45mg/kg的PD单次静脉给药是最合适的剂量。第二部分PD对MODS大鼠的治疗作用和机制探索方法实验分为sham组,MODS+NS组和MODS+PD组。sham组和MODS+NS组的操作同前,MODS+PD组大鼠每次给药为等容积的PD(45mg/Kg)。为评估MODS诱导24小时后大鼠多脏器情况(每组8只)。血清生化指标(BUN, CR, TBIL, LDH, CK, ALT,AST)、动脉血气分析、晚期氧化蛋白产物(advance oxidative protein products,AOPPs)和炎症因子(IL-1, IL-6, TNF-α)分别被测定。之后颈椎脱臼法处死大鼠,取肾、肺和肝组织常规固定HE染色,免疫组化法测定凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Cytochrome C)和ELISA法测定肾和肝匀浆的caspase-3活性(每组6-8只)。采用SPSS13.0软件录入数据,Kaplan-meier法进行各组生存时间分析,One-way ANOVA方法比较各组平均数±标准差,LSD-t法检验多重样本均数。结果1.PD对于MODS大鼠模型整体生存时间的影响sham组的大鼠48小时均存活。MODS+PD组和MODS+NS组的中位数生存时间为分别为49小时和29小时,PD处理后实验大鼠的中位数生存时间明显延长。2.PD对MODS大鼠模型主要血液生化指标和动脉血气的影响和MODS+NS组相比,MODS+PD组所有的血生化值均显著降低(图3)。血气参数包括pH值、血乳酸、碱剩余和HC03-在MODS+PD组均有改善,以上参数两组比较均具有统计学意义(P<0.05)。3.PD对MODS大鼠的病理的影响在MODS+NS组中,肾、肝和肺的病理均出现了病变。部分近端肾小管上皮细胞出现浊肿、变性、细胞部分缺失、管腔狭窄,有的管腔伴有少量血栓沉积；部分肝中央静脉缩小,肝窦扩张充血,肝细胞胞浆呈混浊肿胀,许多肝细胞出现气球样变或退行性变；肺间质水肿和扩大,部分肺泡萎陷,血管和间质周围有许多炎症细胞浸润。与NS组比较,PD45mg/Kg给药组肾脏、肝脏和肺脏的病理损伤均有减轻。4.PD对MODS的大鼠血清AOPPs水平的影响MODS+NS组血清AOPPs明显增高,PD治疗组血清AOPPs浓度显著下降。较sham组比较,两组的增高率分别为77.4%和33.5%,两组间比较具有统计学意义(F=7.919,P<0.05)。5.PD对MODS大鼠肾脏、肝脏和肺脏组织凋亡相关蛋白表达的影响与MODS+NS组相比,MODS+PD组在肾脏和肝脏组织胞质细胞色素C免疫组化染色的相对灰度值均显著减少。各组肺组织蛋白表达之间无显著差异。(两组在肾脏和肝脏组织的相对值分别是110%vs30.2%,F=70.4,P<0.01；40%vs11.2%,F=22.4,P<0.05)。与MODS+NS组相比,MODS+PD组在肾脏和肝脏组织Bax蛋白免疫组化染色的相对灰度值均显著减少。各组肺组织蛋白表达之间无显著差异。(两组在肾脏和肝脏组织的相对值分别是67.1%vs24.2%,F=110.7,P<0.01；49.6%vs34.1%,F=67.4,P<0.05)。与MODS+NS组相比,MODS+PD组在肾脏和肝脏组织Bcl-2免疫组化染色的相对灰度值均显著增加。各组肺组织蛋白表达之间无显著差异。(两组在肾脏和肝脏组织的相对灰度值在肾脏和肝脏分别是9.9%vs31.4%,F=21.1,P<0.01；18.3%vs33.3%,F=4,P<0.05)。同sham组相比,MODS+NS组和MODS+PD组中caspase-3活性增高明显。然而,MODS+PD组的caspase-3的活性显著低于MODS+NS组且两组间比较具有统计学意义。(肾脏52.1%vs148%,F=44.5,P<0.01；肝脏39.8%vsl23.8%,F=27.9,P<0.01)。6.PD对MODS大鼠血清炎症细胞因子水平的影响同sham组相比,MODS+NS组和MODS+PD组的三种细胞因子水平均升高。然而,这些指标在MODS+PD组明显低于MODS+NS组,且两组间比较均具有统计学意义(IL-6：12倍vs8倍,F=33.6,P<0.01；TNF-α:13倍vs10倍,F=77.5,P<0.05;IL-1：8倍vs5倍,F=41,P<0.05)。结论PD改善了MODS大鼠多个器官(肝、肾和肺)的功能和整体生存时间。它的作用机制可能与抑制氧化应激、降低炎症反应和抑制激活线粒体介导的凋亡途径等有关。