第一部分 丝素(SF)/羟基磷灰石(HA)三相骨软骨仿生支架的制备及其材料结构和性能的表征[目的]构建具有多层结构的骨软骨仿生支架,利用聚多巴胺(PDA)对支架进行修饰,对支架相关理化性能进行表征,并评估支架载药效率及缓释效果。[方法]配制不同浓度丝素溶液,采用冷冻干燥以及甲醇浸泡的方法制备支架,根据软骨、软骨下骨及骨的解剖特征,选择合适浓度溶液分别用于制备软骨相及界面层的丝素支架。通过高温烧结法制备羟基磷灰石支架作为骨相支架。通过重复冻融法将羟基磷灰石支架与丝素支架接合为三相骨软骨仿生支架。利用PDA对支架表面进行修饰后负载血小板衍生生长因子(PDGF),将支架分成4组:空白支架组(HSF组)、支架物理吸附PDGF组(HSP-1组),支架PDA修饰组(HSP-2组)、支架PDA修饰后负载PDGF组(HSPP组)。采用扫描电镜(SEM)扫描支架表面及切面结构,结合Nano Mesurer软件分析支架孔径分布情况,采用液体置换法计算支架的孔隙率,计算支架吸水率分析其亲水性能,采用傅里叶红外光谱(FTIR)分析支架的化学基团和化学键,同时检测支架生物力学性能。最后,采用酶联免疫法(ELISA)法检测支架在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、21天和28天时PDGF的释放量,评估其载药效率及释放性能。[结果]经过筛选,本研究最终选用5%的SF溶液用于软骨相支架制作,20%的SF溶液用于界面层支架的制作,其制得的支架分别为110.13±29.38μm和96.53±33.72 μm;通过SEM观察可见支架整体呈海绵状结构,表面和切面均为蜂窝形态,各组支架的孔隙率分别为 42.5±6.6%,44.9±8.1%,42.3±4.3%,41.7±5.4%,没有明显差异(P>0.05)。FTIR结果发现波峰主要出现在1650 cm-1、1516 cm-1和1232 cm-1处,分别为SF和HA的特征峰,负载PDGF对波峰影响不明显。各组支架吸水率均无明显差异(P>0.05)。生物力学测定显示各组支架的压缩模量均在8 kPa左右,各组间差异无统计学意义(P>0.05)。SP组在第1天就突释了 52.5±3.31%,第3天的时候累计释放达到67.74±5.43%,在第28天的时候累积释放73.41±1.72%;而SP-PDA组,第一天仅释放了 12.53±1.15%,并在接下来的4周内继续释放,并在最终第28天时累计释放达到71.74±5.38%。[结论]本部分实验制备的丝素/羟基磷灰石三相骨软骨仿生支架具备良好的孔径、孔隙率、亲水性能和力学性能,经PDA修饰后可以实现PDGF的缓慢而持续释放。第二部分 丝素/羟基磷灰石三相骨软骨仿生支架促进SMSCs体外迁移、增殖和成软骨分化的性能研究[目的]探讨丝素/羟基磷灰石三相骨软骨仿生支架促进兔滑膜间充质干细胞(SMSCs)体外迁移、粘附、增殖以及成软骨分化的能力。[方法]通过组织酶消化法获得SMSCs,利用有限稀释法获得纯化的原代SMSCs株,采用流式细胞技术对其表型进行鉴定,并通过成骨、成软骨和成脂肪诱导对SMSCs多系分化能力进行鉴定。选用第三代SMSCs,检测支架的生物相容性,将细胞种植在支架上,在第1天和第7天用SEM观察细胞在支架上的粘附形态和长入情况;在第1天、第3天、第5天和第7天,用CCK-8法检测细胞增殖情况。通过Transwell共培养法检测载药支架促进细胞迁移的能力。采用Transwell共培养,通过细胞骨架染色和核染,观察SMSCs成软骨分化后骨架蛋白和胞核形态变化情况;采用团块法培养,通过组织切片染色来评估SMSCs向软骨分化的能力。另外通过检测共培养时各组上清液中软骨标志蛋白的含量变化情况来评估支架促分化能力。[结果]提取纯化后的SMSCs经过流式细胞技术进行表型鉴定,表面抗原CD90和CD105表达分别为99.90%和97.90%;CD34为0.00%;SMSCs经过诱导后可成功向骨、软骨和脂肪方向进行分化。SMSCs在各组支架上粘附良好,在SPP组支架上增殖能力最强。SPP组支架具有显著的促进细胞迁移的作用,相对于SF组、SP-1组和SP-2组差异有显著统计学意义(P<0.05)。支架诱导SMSCs成软骨分化7 d后,细胞核及骨架染色观察可见SPP组中细胞的数量增多明显,活力更好,骨架染色显示骨架蛋白更具有取向性,符合浅表层正常软骨细胞表现。SMSCs经团块悬浮培养后,SPP组甲苯胺蓝和阿尔新蓝染色提示大量软骨细胞外基质产生。SPP组释放的PDGF具有促进SMSCs合成Ⅱ型胶原蛋白及葡聚氨糖的能力,且同时不增加Ⅰ型胶原蛋白的合成。[结论]丝素/羟基磷灰石三相骨软骨仿生支架生物相容性良好,能促进SMSCs在支架上粘附、增殖,在体外有促进SMSCs迁移的作用,具备良好的促进SMSCs向软骨分化的能力。第三部分丝素/羟基磷灰石三相骨软骨仿生支架在兔骨软骨缺损模型修复中的应用[目的]探讨丝素/羟基磷灰石三相骨软骨仿生支架促进兔自身SMSCs迁移至骨软骨缺损部位行软骨修复的可行性。[方法]根据术前设计,将50只性成熟新西兰大白兔随机分为5组,分别为空白对照组,HSF支架组,HSP-1支架组,HSP-2支架组,HSPP支架组。构建兔膝关节骨软骨缺损模型,按照分组分别植入支架,在术后12周和术后24周进行MRI影像学检查,评估软骨修复情况。在术后12周和24周时分别取材进行标本大体组织学评分、组织学染色和免疫组织化学染色观察软骨再生、细胞外基质分泌及支架降解情况。[结果]通过对各组修复组织的大体观察可见,与HSF支架组,HSP-1支架组,HSP-2支架组相比,HSPP组获得了更为满意的结果。HSPP组修复组织的大体形态评分结果明显高于对照组(P<0.05)。各组的MRI影像学评分发现,HSPP组在较早期即可实现软骨的再生,软骨修复进程明显优于其他组(P<0.05)。对各组修复组织的组织学分析发现,HSPP组的新生骨软骨组织的形态更优于其他组,软骨特异性染色阳性率明显高于其他组,尤其是在术后24周,接近于正常骨软骨组织。免疫组织化学结果显示修复组织含有大量Ⅱ型胶原,且我们发现HSPP组支架的降解程度亦较高,分析认为与细胞大量粘附增殖产生的炎症反应可以加速支架材料的降解有关。[结论]载PDGF丝素/羟基磷灰石三相骨软骨仿生支架可在兔膝关节骨软骨缺损部位招募周围滑膜中的SMSCs,并在PDGF诱导下向软骨分化,实现骨软骨损伤的再生修复。