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目的: 本研究通过基因克隆建立稳定表达HLA-G1或HLA-G5异构体的K562细胞株，以及通过流式细胞术检测NK细胞膜表面CD107a分子的表达水平，旨在探讨肿瘤细胞不同程度表达HLA-G1或分泌HLA-G5抗原对NK细胞杀伤活性的影响。 方法: 1.HLA-G1或HLA-G5真核表达载体构建、转染及鉴定将HLA-G1或HLA-G5全长基因连接到真核表达载体pVITR02 mcs上，经限制内切酶双酶切及测序鉴定质粒构建正确性。将测序正确的HLA-G1/pVITR02-mcs和HLA G5/pVITR02-mcs及阴性对照pVITR02-mcs转染到K562细胞株中，用潮霉素进行筛选，获得稳定表达HLA-G1/HLA-G5K562细胞株，并用流式细胞术(MEM-G/09抗体)、western blot(4H84抗体)进行鉴定。 2.靶细胞杀伤实验K562-HLA-G1和K562细胞按不同比例混合培养获得不同表达量mHLA-G1-K562细胞群;K562 HLA-G5细胞培养上清用倍比稀释法获得不同表达浓度的sHLA-G5;将NK-92MI细胞分别与两种K562细胞群以5∶1的比例混合培养，1小时后加入莫能菌素;再过3h后加入CD107a和CD56抗体，用流式细胞术测定CD56+NK细胞群CD107a的表达率。 3.NK细胞表面受体和抗体阻断实验分别采用单克隆抗体ILT2-PE、ILT4-FITC、KIR2DL4-PE检测NK-92MI细胞株表面的ILT2、ILT4、KIR2DL4受体的表达。将靶细胞K562-HLA-G细胞群与87G抗体共孵育30min，加入效应细胞NK-92MI，效靶比为5∶1，一式三份，重复三次，用流式细胞术检测CD56+NK细胞群CD107a的表达率。 结果: 1.HLA-G1或HLA-G5真核表达载体构建、转染及鉴定经限制性内切酶双酶切及测序证实HLA-G1/pVITR02-mcs和HLA-G5/pVTR02-mcs构建成功，经western blot、ELISA及流式细胞术证实HLA-G转染K562细胞株成功。 2.靶细胞杀伤实验将不同表达量mHLA-G1-K562细胞群和不同表达浓度的sHLA-G5培养上清分别与NK-92MI细胞以效靶比5∶1的比例混合培养，检测HLA-G1、HLA-G5抗原对NK杀伤活性的影响，结果显示，HLA-G异构体依赖其表达量高低发挥免疫抑制功能;与膜结合型HLA-G1相比，可溶性HLA-G5具有更强的抑制NK细胞杀伤活性的能力(P＜0.05)。进一步研究指出，不同程度表达的HLA-G1或HLA-G5抗原均能显著抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，并且两者具有累加效应。 3.NK细胞受体表达及HLA-G抗体阻断实验用流式细胞术检测NK-92MI细胞株表面的ILT2、ILT4、KIR2DL4受体的表达，实验数据表明:NK-92MI细胞表面ILT2受体表达率99.87％，KIR2DL4呈膜表面弱表达，而ILT4未检测到;将靶细胞K562-HLA-G细胞群与87G抗体共孵育30min，加入效应细胞NK-92MI，效靶比为5∶1，一式三份，重复三次，用流式细胞术检测CD56+NK细胞群CD107a的表达率。结果显示:当K562-HLA-G1靶细胞表面的HLA-G1抗原被87G抗体封闭后，NK细胞介导的细胞溶解百分比显著增加(p＜0.01，)，但其活性末完全恢复(p=0.03)。 结论: HLA-G异构体依赖其表达量高低发挥免疫抑制功能;与膜结合型HLA G1相比，可溶性HLA-G5具有更强的抑制NK细胞杀伤活性的能力（P＜0.05）。进一步研究指出，不同程度表达的HLA-G1或HLA-G5抗原均能显著抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，并且两者具有累加效应。这将为肿瘤细胞或病毒感染细胞逃逸宿主的免疫监视提供更有力的理论依据。