噬菌体防控肠炎沙门氏菌生物被膜的效果研究

来源 :大连理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zdf657094142
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有害生物被膜造成的问题一直潜在的影响着医疗、食品加工、甚至工业生产等行业。沙门氏菌是最常见的食源性致病菌之一,其生物被膜的形成会降低其对抗生素和消毒剂的敏感性,一旦在食品加工或养殖环境中形成将难以根除,进而造成食品安全问题和经济的损失。自噬菌体回归人们的视野,围绕其展开的研究逐年增加,在防控生物被膜方面也表现出色,怎样使噬菌体发挥其最大的作用一直是需要不断探索的问题。基于上述问题,本论文以沙门氏菌噬菌体为研究对象,评价单一噬菌体与两株噬菌体混合对沙门氏菌生物被膜的预防和清除的效果,并探究噬菌体与次氯酸消毒液组合应用对沙门氏菌生物被膜的影响,主要工作如下:(1)对实验室现存沙门氏菌进行生物被膜形成能力的测定,选取生物被膜形成能力最强的肠炎沙门氏菌S5为本研究的目的菌株,并测定其生长曲线。以肠炎沙门氏菌为宿主,分离得到3株噬菌体,分别命名为S124、S528和S532。通过透射电镜观察,3株噬菌体均为有尾噬菌体目,NCBI数据库的分类结果显示S528与S532属于长尾噬菌体科,S124属于德默莱兹噬菌体科。在液体培养下,S124在MOI为1,S528和S532在MOI为0.01时抑菌效果最好。噬菌体S124分别与噬菌体S528和S532混合,可将抑菌时间增加至6 h。噬菌体S124在p H为8-11区间内稳定存在,噬菌体S528和S532在p H为5-11区间稳定存在,3株噬菌体在温度-20℃至60℃之间均可保证高存活率。通过宿主谱测定结果显示,噬菌体S124的宿主谱更广,可裂解8株菌沙门氏菌,S532与S528可裂解7株沙门氏菌。通过生物学特性确定S528与S532特征相似,故后续研究围绕S124与S532展开。(2)3株噬菌体的全基因组测序结果显示,S124、S528和S532的遗传物质均为双链线性DNA,基因长度分别为110,832 bp、42,662 bp和43,620 bp。S124基因组的GC含量为39.18%包含151个开放阅读框,59个具有已知功能;S528基因组的GC含量为49.67%,包含68个开放阅读框,39个具有已知功能;S532基因组的GC含量为49.72%,包含66个开放阅读框,30个具有已知功能。通过系统发育树构建发现噬菌体S124属于T5样噬菌体。经分析3株噬菌体基因组中未发现整合酶等溶原基因,也不含有抗生素耐药基因与毒力因子,这表明3株噬菌体在基因层面是安全的,可进行后续应用。(3)2株噬菌体单独以及混合预防和清除生物被膜的结果显示,S124与细菌共培养72 h可使生物被膜的生成减少27.3%。S532和噬菌体混合液在与细菌共培养24 h可分别使生物被膜减少72.1%和69.2%。成熟生物被膜被噬菌体处理4 h和6 h均维持在较低的水平,噬菌体S124处理4 h清除率最高可达73.6%。当处理8 h后,噬菌体S124、S532和噬菌体混合液清除率分别为10.2%,50.2%和58.9%。肠炎沙门氏菌S5在不锈钢上的生物被膜形成能力强于石英玻璃,与聚四氟乙烯组无显著差异。当生物被膜在不锈钢片上形成时探究噬菌体和消毒剂对生物被膜内活菌数的影响,S532与噬菌体混合液效果一致可减少生物被膜内31.0%的活菌。当噬菌体预处理4 h后,加入次氯酸消毒液可使生物被膜内活菌降低不可检出水平。噬菌体S124对次氯酸消毒液较为敏感,处理1 h后全部失活,而S532在次氯酸消毒剂处理6 h后效价仍高于10~4PFU/m L。本论文以实际应用为导向,力求解决噬菌体单独应用的局限性,为后续噬菌体作为生物防治剂防控沙门氏菌生物被膜提供理论依据和研究基础。
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