生物标志物作为一种特征性的生化指标,一般在疾病研究中可实现对其的客观检测和评估,通过对它进行检测可以了解当前机体所处的生物学进程。测定某种具有疾病特异性的生物标志物,对于疾病的鉴定、早期诊断和防治都能起到很大作用,尤其在慢性疾病与复杂疾病(如心血管疾病、糖尿病、肿瘤等)的防控中突显出重要价值。随着人们健康和生活要求标准的不断提高,现代医学和分析技术也发生着日新月异的变化,依靠一些简单、灵敏且高效的检测手段来对疾病标志物进行检测同样是势在必行的。其中,荧光生物传感器就是一种能特异性识别生物分子并将这种识别转化成可以检测到的荧光信号的装置。因此,本论文利用多种信号放大技术,包括滚环扩增、Toehold介导的链置换与多重循环扩增,分别实现了对miRNA let-7a、血小板衍生生长因子BB和端粒酶的高选择性灵敏检测。本文的具体研究内容如下:1.基于发夹/DNA环三元探针对家族成员中microRNA的高灵敏度和选择性检测microRNA(miRNA)的检测和定量在临床和生物医学研究中具有重要意义。然而,由于mi RNA具有家族序列相似、长度短、丰度低等特点,使得对miRNA进行高选择性和灵敏性检测具有重大的挑战。在这里,我们设计了一种新的发夹/DNA环三元探针,提出并描述了一种用于灵敏和选择性地从癌细胞中检测miRNA的滚环扩增(RCA)方法。目标物miRNA通过toehold介导的链置换(TSD)与发夹/DNA环探针结合形成三元结构,其中结合的miRNA和DNA环分别作为引物和模板来实现RCA,从而产生了许多重复的金属离子依赖性DNA酶序列。在缓冲液中存在相应的金属离子的情况下,荧光猝灭的发夹信号探针可以通过这些DNA酶序列被循环地切割,从而获得显著恢复的荧光,并在10 fM~10 n M的范围内,实现了对miRNA的高灵敏检测,检测限为1.51 fM。同时,利用TSD的高碱基错配识别能力,该方法可以在相应的家族成员序列中实现对目标物miRNA的选择性检测。此外,该方法还能对癌细胞中miRNA的表达差异进行区分,以筛选潜在的治疗药物。2.一种三元探针用于目标物引发的自主多分支滚环放大对血小板衍生生长因子BB进行高灵敏比色检测蛋白质生物标志物的高灵敏度检测在临床诊断和疾病治疗中具有重要意义。在新设计的包含适配体、引物和环状DNA序列的三元探针的基础上,我们构建了一种免标记、超灵敏的比色传感器,通过目标物引发的自主多分支滚环扩增(mbRCA)策略来检测蛋白生物标记物血小板衍生生长因子BB。三元探针中的适配体序列与目标物特异性结合,使得引物发生构象转换,在辅助发夹的作用下触发mbRCA反应产生大量G-四联体序列。血红素进一步与这些G-四联体结合,产生许多具有类似辣根过氧化物酶功能的血红素/G-四联体DNA酶,它催化底物溶液产生强烈的颜色转变,从而在0.1至1000 pg mL-1范围内实现对目标物分子的超灵敏和无标记比色检测,检测限为0.055 pg mL-1。这种基于适配体的传感方法具有很高的选择性,可以实现对稀释血清中低水平蛋白质生物标志物的检测,为将该方法用于早期疾病诊断中检测其他微量蛋白质生物标志物提供了新的途径。3.基于多重循环扩增传感器对癌细胞中端粒酶的免标记和高灵敏检测发展高灵敏度和选择性的端粒酶检测方法,对与端粒酶有关疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。在这方面,我们在这项工作中描述了建立一种端粒酶引发和切割内切酶辅助的级联循环信号放大的方法,用于癌细胞中端粒酶的无标记和高灵敏度荧光检测。目标物端粒酶引发部分双链DNA中一条预先设计好序列的链的延伸,从而诱导单链DNA的释放,在Nt.AlwI核酸内切酶的作用下,通过切割两个发夹信号探针来引发三个级联循环,从而产生许多G-四联体序列。硫黄素染料进一步结合这些G-四联体序列,获得显著增强的荧光,实现对端粒酶的灵敏检测,检测限为8.93×10-11 IU。此外,该方法还能对不同肿瘤细胞中的端粒酶活性进行鉴别,并筛选出用作抗肿瘤药物的端粒酶抑制剂。