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研究背景和目的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和人包皮成纤维细胞(HFFs)是人类胚胎干细胞(hESCs)建系和维持最常用的饲养层。MEFs和HFFs在hESCs增殖和状态维持方面均有差异,且对hESCs的心肌细胞分化潜能有影响。本研究目的是评价MEFs和HFFs对hESCs的多巴胺能神经分化的影响。研究方法为了使培养条件变异对神经分化影响的最小化,本研究选用了自有的、在MEFs建系的HN4人胚胎干细胞系和在混合饲养层(MFCs,MEFs:HFFs = 1:1)建系的P96人胚胎干细胞系。分化实验在无饲养层培养系统中完成。采用SMAD通道双抑制剂诱导启动多巴胺能神经分化,采用倒置相差显微镜、免疫细胞化学法、实时荧光定量PCR、扫描电镜和透射电镜、以及膜片钳等检测方法从形态学、分子生物学标记物、转录因子基因表达、三维超微结构、电生理特性等方面分析人胚胎干细胞源多巴胺能神经元的各种特征。通过SPSS19.0软件进行分析。P<0.05认为有统计学差异。研究结果HN4和P96细胞系在分化过程中均表现出从典型铺路石样、高核质比的干细胞形态分化为典型神经元的形态学变化过程。HN4和P96源神经元均表达多巴胺脱羧酶(TH)阳性,P96系分化细胞中TH阳性细胞比率更高(P<0.05)。扫描电镜和透射电镜结果显示HN4和P96源多巴胺能神经元均显示典型的神经元形态及突触结构,并形成复杂的神经网络。实时荧光定量PCR结果显示,与HN4神经元相比,P96神经元FOXA2、PITX3、NURR1、TH表达上调(P<0.05)。膜片钳结果显示:在电压钳模式下,HN4和P96源多巴胺能神经元均记录到了电压门控性钠、钾离子电流,Y-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)等配体门控性电流及自发性突触后电流。在电流钳模式下,HN4和P96源多巴胺能神经元均记录到了动作电位序列发放。动作电位发放的个数与去极化电流的强度均呈线性关系。HN4和P96源多巴胺能神经元动作电位时程均大于2mS。HN4,和P96源多巴胺能神经元静息电位分别为-63.38 ± 0.01和-58.7 ± 0.04 mV,阈电位分别为-36.15 ± 0.34和-39.58 ± 0.17 mV,两者差异呈显著性。HN4和P96源多巴胺能神经元对去极化注射电流刺激均呈现出“爆发”性的放射模式,在连续发放的动作电位序列中,动作电位幅度递减,而动作电位的时程逐渐延长。研究结论1、在MEFs和HFFs上的建系的人胚胎干细胞系HN4及P96均可以分化为形态成熟的多巴胺能神经元,并且形成复杂的神经网络及典型的突触结构;P96细胞系更倾向于分化为多巴胺能神经元。2、在MEFs和HFFs上的人胚胎干细胞系HN4及P96均可以分化电生理功能成熟的多巴胺能神经元;P96源多巴胺能神经元兴奋性更高。