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目的运用高通量测序和生物信息学技术手段,分析与筛选新的可能参与细胞自噬调控的miR-129-3p;探究miR-129-3p通过靶向调控自噬相关基因Atg4b进而影响细胞自噬以及结核分枝杆菌发生免疫逃避的机制。方法利用雷帕霉素和3-MA制备细胞自噬模型,采用高通量测序技术获得miRNAs差异表达谱;利用miRWalk 3.0、DAVID、STRING等数据库对miR-129-3p及其靶基因Atg4b做功能GO注释、KEGG通路和蛋白互作功能分析。利用RT-qPCR检测mi R-129-3p在自噬以及BCG感染细胞模型中的表达量。构建pMIR-Report-Atg4b-WT/MUT载体;通过荧光素酶报告实验、RT-qPCR、Western Blot等方法验证miR-129-3p对Atg4b的靶向调控作用。利用Western Blot检测细胞自噬标志蛋白LC3和p62的表达变化,激光共聚焦显微镜检测LC3在胞质内分布情况。最后通过CFU实验检测miR-129-3p对BCG胞内存活量的影响。结果1.经生物信息学分析发现,miR-129-3p的靶基因Atg4b具有很多与细胞自噬相关的功能,且涉及多条细胞自噬信号通路,据此作为研究对象。2.BCG感染RAW264.7细胞后,miR-129-3p表达量随MOI增高而增加,提示miR-129-3p与BCG感染程度相关。MiR-129-3p的表达量随时间延长而升高,在12小时达到最大值,随后有所下降。说明miR-129-3p在结核分枝杆菌感染早期发挥作用,随后会被细胞内某些物质反馈调节。3.双荧光素酶实验结果显示,miR-129-3p mimic可以显著抑制pMIR-Report-Atb4bWT组的荧光素酶活性,miR-129-3p antagomir可以增强荧光素酶活性。而在pMIR-Report-Atb4b-Mut组中,荧光素酶活性没有变化。说明miR-129-3p可以靶向结合Atg4b的3’非翻译区抑制其表达。同时,qRT-PCR结果显示mi R-129-3p mimic可以抑制Atg4b mRNA表达水平,antagomir可以提高Atg4b mRNA表达量;Western Blot结果表明miR-129-3p mimic可以降低Atg4b蛋白表达量,miR-129-3p antagomir可以提高Atg4b表达量。这说明miR-129-3p可以在转录水平靶向调控Atg4b的表达。4.Western Blot结果显示,miR-129-3p过表达可以抑制Atg4b和LC3I表达,p62蛋白集聚增多;miR-129-3p antagomir可以提高Atg4b、LC3I和LC3II的表达,增加p62蛋白的降解导致其含量降低。免疫荧光结果显示miR-129-3p mimic使LC3均分布在细胞质中,miR-129-3p antagomir可以使LC3点状聚集增多。说明miR-129-3p可以抑制自噬体形成,抑制细胞自噬水平。5.CFU结果表明,mi R-129-3p mimic可以增加BCG的胞内存活量,相反,mi R-129-3p antagomir可以降低BCG的胞内存活。结论本实验发现一个新的与细胞自噬相关的miRNA:miR-129-3p。并且证明miR-129-3p可以靶向抑制自噬相关蛋白Atg4b来调控自噬小体的生成,进而影响细胞自噬水平,促进胞内寄生BCG的存活,对探究MTB潜伏感染和免疫逃避具有重要作用。