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目的：本课题拟设三个部分进行实验研究。第一部分从细胞水平和组织水平明确TPX2在宫颈不同生理或病理状态下表达的差异性，了解从正常宫颈上皮到CIN再到宫颈浸润癌组织中的TPX2蛋白的表达水平，并结合病例分析，探讨其与宫颈癌的临床分期、病理分化程度和淋巴转移的关系。第二部分探讨小干扰RNA靶向沉默TPX2基因对宫颈鳞癌SiHa细胞的生物学行为影响。第三部分基于RNAi构建稳转染HeLa细胞株，探讨RNAi抑制TPX2蛋白表达对细胞生物学行为的影响和激活p53、p21、Rb细胞信号转导通路的可能性。方法：选取HPV阳性型的人源宫颈鳞癌SiHa细胞株、宫颈腺癌HeLa细胞株和经医学伦理委员会审查同意后且经病理切片诊断证实的97例不同宫颈组织标本作为实验研究材料。第一部分实验采用Western-Blot免疫印迹分析、RT-PCR和免疫组化研究宫颈不同生理或病理状态下TPX2的表达情况。第二部分实验利用RNAi对SiHa细胞中的TPX2基因进行特异性抑制，通过流式细胞术、MTT和侵袭试验检测TPX2抑制后对细胞生物学行为的影响。第三部分构建重组担载TPX2-shRNA的真核载体质粒，并转染HeLa细胞，构建稳转染HeLa细胞株，采用Q-PCR、Western-Blot免疫印迹分析法、MTT、流式细胞术、TUNEL法观察TPX2-shRNA对HeLa细胞的生物学行为的影响以及E6、TPX2、p53、p21、Rb之间的可能相互作用机理，探讨高危型HPV感染后E6、TPX2激活p53、p21、Rb细胞信号和介导细胞信号转导的可能性。结果：第一部分实验结果为TPX2蛋白和TPX2mRNA在CIN、宫颈鳞癌组织、宫颈腺癌组织、宫颈鳞癌细胞SiHa和宫颈腺癌细胞HeLa均有不同程度的表达，但是在正常宫颈上皮组织内，TPX2几乎不表达；随着病情发展，从CINⅠ到CINⅢ的不同宫颈组织的TPX2蛋白表达逐渐增强，宫颈浸润癌临床II期的TPX2表达水平高于I期，淋巴转移阳性的TPX2表达水平高于阴性，病理学低分化的TPX2表达水平高于高分化。第二部分实验结果为TPX2-siRNA转染细胞后，随转染时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高；在转染后出现细胞增殖减慢，细胞增殖受到抑制，细胞侵袭能力下降，细胞周期受到调控，主要表现为G1期细胞比例下降，S期和G2期细胞比例升高。第三部分实验成功构建稳定转染重组TPX2-shRNA质粒的HeLa细胞株，对细胞内TPX2的表达起到了特异性抑制，Western-Blot和Q-PCR实验说明TPX2-shRNA在下调TPX2的同时还能够在转录和翻译水平上下调E6，对p53、p21、Rb也具有下调作用，证实TPX2-shRNA具有激活p53、p21、Rb细胞信号的能力，RNAi沉默TPX2后介导细胞信号转导的具体作用机制可能是TPX2被靶向沉默后恢复野生型p53的功能活性，促进细胞凋亡。RNAi沉默TPX2后对细胞周期的调控主要存在两种途经，一方面，p53通过调控其下游靶基因p21的转录和翻译，刺激p21WAF1/CIP1的表达调控细胞周期，p21WAF1/CIP1能够通过引起Rb蛋白磷酸化调控细胞周期；另一方面，从Rb介导的细胞信号转导通路来看，Rb基因通过G1/S期限制点调控细胞周期，Rb蛋白的磷酸化状态决定了细胞增殖能力，非磷酸化Rb可与转录因子E2F结合，Rb蛋白转变为磷酸化后释放具有活性的游离E2F，调控细胞增殖。E6基因通过其产物E6蛋白使具有抑癌作用的非磷酸化Rb蛋白转化为磷酸化Rb蛋白。野生型p53可以同非磷酸化的Rb作用，通过依赖p53诱导的细胞凋亡途经保护Rb的抑癌功能，促使磷酸化Rb蛋白转化为非磷酸化Rb。此外，高危型HPV的E7蛋白可以结合Rb使E2F游离，活化S期转录。RNAi的效果越好，细胞增殖活性受到抑制的程度越明显、细胞凋亡数量越多，停顿于S期和G2/M期的细胞比例越大。结论：在宫颈鳞状细胞癌、CIN、宫颈腺癌组织中均存在TPX2过表达，TPX2在正常宫颈组织中几乎不表达；在宫颈上皮细胞从正常到癌变的发展过程中，TPX2表达含量逐渐增多；宫颈癌的临床分期、病理分级和转移均与TPX2过表达水平密切相关，TPX2过表达水平越高，临床分期越晚、病理分化越差、越容易发生淋巴结转移。RNAi特异性沉默SiHa、HeLa细胞的TPX2后不仅能够调控细胞周期，使细胞周期在S期及G2/M期停顿，而且能够抑制细胞的增殖活性和侵袭能力，TPX2-shRNA能够使细胞发生凋亡。成功构建了稳转染TPX2-shRNA重组质粒的HeLa细胞株，证实了高危型HPV感染后TPX2在转录和翻译水平上均与E6关系密切，TPX2-shRNA能够激活p53、p21、Rb细胞信号通路，介导细胞信号转导途经、调控细胞周期、诱发细胞凋亡；E6、TPX2通过抑制p53、p21、Rb的抗癌功能，使细胞周期检查点功能缺陷，使正常状态的细胞发生癌变。RNAi干扰能够有效抑制TPX2的过表达，保护p53、p21、Rb的正常功能状态，基于RNAi技术抑制TPX2基因的表达可对宫颈癌的发生和进展起抑制作用，TPX2基因有望成为一种新的宫颈癌早期诊断和基因治疗的候选靶点，为宫颈癌的临床诊断和治疗提供新的思路。