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背景与目的:脲原体(Ureaplasma spp.,UU)是人类泌尿生殖道常见的共生型微生物,常寄居于人体泌尿生殖道粘膜表面,可引起多种感染性疾病。随着UU多位点分型方案的建立,研究人员对少部分UU感染人群进行了分子流行病学研究,并且发现UU不同亚组菌株与疾病的关系存在差异。本研究旨在明确UU在女性不孕患者和男性不育患者的克隆分布情况,以及UU不同亚组菌株间的基因背景学差异,为UU的致病机制研究提供新的思路。方法:1.使用支原体培养试剂盒,分别对浙江大学附属邵逸夫医院确诊的226例女性不孕患者和武警上海市总队医院确诊的480例男性不育患者进行UU筛查。对培养阳性的UU菌株进行种群鉴定,并对单一感染菌株进行多位点序列分型研究;比较分析UU在女性不孕患者和男性不育患者的分布情况;比较分析男性不育患者UU阴性组和阳性组的精液参数,包括精子浓度、精子总活力、前向运动力、非前向运动力和不动精子率。2.选择菌株UPA106(属于亚组A)、UUR132(属于亚组2)和UUR315(属于亚组1),使用二代Illumina和三代Nanopore高通量测序技术对三株菌进行基因组测序。分别选择标准菌株UPA ATCC 27815和UUR ATCC 33699作为微小脲原体(Ureaplasma parvum,UPA)和解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UUR)的参考菌株,分析三株临床菌株和两株参考菌株的全基因组共线性关系和直系同源基因簇;分析UPA106与NCBI Gen Bank数据库中14株UPA的单核苷酸多态性;分析UU132、UUR315和NCBI Gen Bank数据库中18株UUR的单核苷酸多态性;分别分析15个毒力因子在三株菌的变异情况。分别选择与三株菌亲缘关系最近的标准菌株作为参考,进行多带抗原(multiple banded antigen,MBA)家族基因的共线性比对。使用单克隆抗体6522检测三株菌中MBA的表达情况,并对蛋白条带进行质谱检测。使用微量肉汤稀释法研究三株菌对喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类和氨基糖苷类抗生素的耐药情况,并对耐药株进行耐药机制分析。结果:1.女性不孕和男性不育患者分离脲原体的分子流行病学特征(1)女性不孕患者中检测到101株UU,其中85株UPA,11株UUR,5株混合感染株。在85株UPA中发现24个e ST型,e ST16和e ST41是优势克隆株;在11株UUR中发现10个e ST型,e ST82是优势克隆株。(2)男性不育患者中检测到104株UU,其中78株UPA,24株UUR,2株混合感染株。在78株UPA中检出32个e ST型,e ST16和e ST41为优势克隆株;在24株UUR中共检出16个e ST型,e ST82是优势克隆株。(3)在女性不孕患者和男性不育患者中,UPA的检出率均高于UUR。与男性不育患者相比,UUR在女性不孕患者的检出率偏低(P<0.05),并且未检测到UUR的亚组2。(4)与阴性组相比,精子浓度、总活力和前向运动力在UU各亚组呈现不同的变化趋势,但是差异均没有统计学意义(P>0.05),非前向运动力在UUR的亚组2出现明显减低(P<0.05)。2.脲原体不同亚组菌株的基因组学特征和比较基因组学分析(1)UPA106、UUR132和UUR315的染色体均为单个闭合环状结构,基因组全长在741,809~853,955bp,GC含量在25.5%左右,预测的基因数是627~699个。(2)三株临床菌株和两株标准参考菌株的基因组共线性关系良好。在5株菌株中共有652个基因簇,其中541个基因簇(82.98%)构成UU的核心基因。UPA106、UUR132和UUR315分别与菌株ATCC 27818、ATCC 27618和1000间的SNP差异最小。(3)三株菌的谷胱甘肽过氧化物酶编码基因、硫氧还蛋白编码基因和脲酶家族基因均未检测到错义突变。在UPA106和UUR132的O-唾液酸糖蛋白酶编码基因分别检测到点突变A661G(I221V)和G709A(A237T);在UPA106的硫氧还蛋白二硫化物还原酶编码基因中观察到点突变A425G(Y142C);在UUR132的丝氨酸/苏氨酸激酶的编码基因观察到点突变A148G(S50G);在UPA106、UUR132和UUR315的溶血酶编码基因分别检测到点突变A55G(I19V)、A981T(K327N)和A981T(K327N)。(4)在UPA106和菌株ATCC 27818、UUR132与菌株ATCC 27618的MBA家族基因线性比对中均发现,mba基因的N端与基因间区发生了DNA倒置。在UPA106,倒置后的基因与相邻的A0412基因产生基因融合,形成UPA106的mba基因。在UUR132,倒置后的基因与插入的0418基因产生基因融合,形成UUR132的mba基因。在两菌株mba基因的下游均不包含串联重复序列。UUR315和ATCC33696的比对分析发现,mba的N端发生了突变,导致翻译提前终止“MKLLKKKSFFFQNTKKQLFS*”。mba(A0418)的C端发生了DNA倒置,倒置后的C端序列出现在UUR315的02080基因。在UUR315的02090基因中发现了两段包含相同串联重复序列(QAMVQQAQKN)的插入片段。此外,在三株菌mba基因两侧的基因均发现了C端串联重复数目的变异。单克隆抗体6522在UPA106、UUR132和UUR5中分别检测到3个、3个和6个蛋白条带。质谱结果显示,UPA106和UUR132中分子量最大条带分别对应01920基因编码的MBA蛋白和02045基因编码的MBA蛋白。(5)UPA106和UUR132对左氧氟沙星耐药,UUR132对红霉素耐药,三株菌均对四环素敏感。在UPA106的par E基因发现点突变G1343A(R448K),在UUR132的par C基因发现点突变C248T(S83L)。在UUR132的L4、L22和23S rRNA基因均未找到耐药相关突变。结论:1.UU在女性不孕患者和男性不育患者中呈现以优势克隆为主的多克隆分布,优势克隆是e ST16、e ST41和e ST82。2.除MBA家族基因外,UU的毒力因子都很保守,尤其是脲酶家族基因。3.UU中MBA家族基因的突变机制复杂多样。MBA的保守N端可以发生突变,造成该片段的缺失;MBA的N端和C端均可以发生DNA倒置突变;mba基因座内任何下游包含串联重复序列的基因均可以发生C端串联重复数目的突变。插入突变也是MBA的突变机制。