【摘 要】
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防御素是具有广谱杀菌活性的阳离子短肽,在哺乳动物中广泛分布,但自然提取防御素成本极高,且产量极低,所以作为产品,通过基因工程的途径是必然的选择.本论文通过单细胞真核藻
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防御素是具有广谱杀菌活性的阳离子短肽,在哺乳动物中广泛分布,但自然提取防御素成本极高,且产量极低,所以作为产品,通过基因工程的途径是必然的选择.本论文通过单细胞真核藻类高效表达系统的建立,将抗菌谱较为广泛的人防御素HNP-1基因转入绿藻,旨在绿藻中生产防御素.为基因工程生产新型抗生素-防御素奠定基础.本文由反转录PCR方法(RT-PCR)从人体外周血的总RNA中获得编码人α-防御素-l(α-HNP-1)的cDNA.将α-HNP-1克隆到载体pMD18-T中,获得克隆载体pMD18-T/HNP-1.将其热转化至E. coli JM109中,获得了α-HNP-1的cDNA克隆.选择微绿球藻、亚心形扁藻作为表达宿主.研究了他们对抗生素的敏感性,结果亚心形扁藻对氯霉素,微绿球藻对卡那霉素表现出敏感性,其敏感浓度皆为50μg/ml.选择pBI121为表达载体,构建了两个表达系统.亚心形扁藻以氯霉素为抗性标记基因,工作浓度为50μg/ml,微绿球以卡那霉素为抗性标记基因,工作浓度为50μg/ml.电击法将表达载体pBI121 B/HNP-1,pBI121/HNP-1分别转入亚心形扁藻和微绿球藻.在相应抗生素平板上筛选.获得了重组人α-防御素-1基因的亚心形扁藻和微绿球藻.制备重组α-HNP-1基因的两种绿藻的无细胞抽提液,进行抑菌实验,结果表明其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有不同程度的抑菌效果.
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