【摘 要】
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烟草是云南省的一种重要的经济农作物,作为一种固定生物,作物容易遭受生物胁迫和非生物胁迫等环境因子的侵害,严重影响了烟草的经济效益。植物通过蔗糖转化酶（invertase,INV）将蔗糖分解为葡萄糖和果糖,为植物提供生长发育的能源物质,以及作为与外界环境反应的信号因子,因此与植物的抗逆性密切相关。蔗糖转化酶（INV）根据最适p H值,分为酸性转化酶（Acid invertase,AI）和碱性/中性转
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烟草是云南省的一种重要的经济农作物,作为一种固定生物,作物容易遭受生物胁迫和非生物胁迫等环境因子的侵害,严重影响了烟草的经济效益。植物通过蔗糖转化酶（invertase,INV）将蔗糖分解为葡萄糖和果糖,为植物提供生长发育的能源物质,以及作为与外界环境反应的信号因子,因此与植物的抗逆性密切相关。蔗糖转化酶（INV）根据最适p H值,分为酸性转化酶（Acid invertase,AI）和碱性/中性转化酶（Alkaline/Neutral invertase,A/N-INV）。目前关于酸性转化酶的功能及其作用机制已有一些深入的研究,但由于碱性/中性蔗糖转化酶蛋白的非糖基化特征,导致其性质不稳定,因此功能研究还不深入。在水稻、拟南芥等模式植物中的研究表明碱性/中性蔗糖转化酶基因在促进植物抗逆性中具有重要作用,但在烟草中其是否与抗性相关还不清楚。因此,本研究以本氏烟（Nicotiana benthamiana）为实验材料,筛选鉴定出碱性/中性蔗糖转化酶基因家族成员,根据转录水平表达差异与系统发育关系,挑选出5个基因进行深入的功能探究。主要研究成果如下:（1）以拟南芥蔗糖转化酶基因At CInv1（登录号:AM230708）为种子序列对本氏烟基因组数据库进行筛选,鉴定出14个碱性/中性蔗糖转化酶基因。系统发育关系显示14个基因分为两大亚家族（α和β亚家族）;（2）利用RT-qPCR技术检测14个家族成员在冷、热、干旱和盐胁迫处理0-48 h后其叶片中的表达水平,结果显示,14个基因均有不同程度的表达,其中NbCIN1、NbCIN2和NbCIN11基因在盐胁迫、干旱胁迫处理12-24 h后上调较明显;根据14个成员不同表达水平,挑选出NbCIN1、NbCIN2、NbCIN5、NbCIN10和NbCIN11进行后续功能探究;（3）对目标基因进行体外酶活检测和亚细胞定位分析。构建目的基因蛋白表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,提取总蛋白进行体外酶活测定。结果显示NbCIN2在p H为7.0的条件下酶活性较高,约为70%;NbCIN11在p H在7.0-8.0之间活性约为54%,两个基因定位于细胞质基质;NbCIN1在体外活性微弱,亚细胞定位于细胞核中;NbCIN5和NbCIN10则未表现出活性,其亚细胞定位分别于叶绿体和内质网中;（4）构建NbCIN1、NbCIN2和NbCIN11的过表达载体,利用农杆菌介导转化本氏烟,获得稳定转化株系,收集T1代种子进行种植并获得T1代转基因烟苗。检测T1代烟苗叶中的脯氨酸含量。结果显示,与野生型相比,过表达植株NbCIN2和NbCIN11脯氨酸含量相比野生型显著增多,脯氨酸含量增长了约2.5倍,为后期开展植株抗逆性表型测定奠定基础。
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