正畸治疗过程中牙位移动的原理是:持久的矫治力作用在牙齿上,牙齿周围的骨组织发生改建,从而引导牙齿的移动,是建立在牙周组织受力后发生的生物学改建基础上,包括牙齿及其周围的附着结构如牙骨质、牙周膜及牙槽骨的移动改建。但牙的移动并不是简单的机械移位,在整个过程中,成骨细胞和破骨细胞的共同参与,相互协调使牙槽骨发生选择性吸收和形成即在压力侧发生骨的吸收,张力侧有新骨的形成。而牙槽骨的改建由牙周膜介导,因此牙齿移动首先表现为牙周膜现象。在牙周膜中存在一种有多向分化,自我更新,克隆形成能力的干细胞,即人牙周膜干细胞(PDLSCs),它为牙周组织包括牙槽骨的再生提供新的细胞来源。研究表明,牙周膜干细胞在应力作用下可分化为成骨细胞和软骨细胞,在牙槽骨改建的起着关键作用。干细胞向成骨细胞转化并不是一个单一的过程,而是由众多生长因子和通路共同作用的结果。但其具体机制目前还不十分清楚。Hedgehog信号参与了胚胎发育期间各种组织器官的形成,特别是在骨的生长发育过程中起了重要的调节作用。研究表明,Hedgehog信号途径介导了间充质干细胞(MSCs)向成骨,软骨细胞转化和软骨骨化的一系列过程。多种因素可直接或间接通过调控Hh信号通路从而使间充质干细胞向成骨细胞分化。本课题组前期证实了周期性张应力可促进PDLSCs向成骨细胞分化,并证实了Hh信号通路参与了PDLSCs应力成骨过程。Glil(Gliloma-associated oncogene homoglog)是Hh信号通路中重要的转录因子,是该通路激活的最重要标志,其如何通过调控Hh信号通路来影响PDLSCs成骨的分子机制还少有研究。因此,本实验拟构建过表达Glil基因腺病毒载体,并转染PDLSCs细胞,探讨上调Glil基因对PDLSCs增殖及其在应力作用下成骨分化的影响,为进一步了解在应力作用下牙齿生理性移位时牙槽骨的改建机制而打下一定的实验基础。目的通过体外构建Glil基因腺病毒载体,以此上调人牙周膜干细胞(PDLSCs)中Glil基因的表达,从而探讨其对人PDLSCs增殖及应力成骨分化的影响方法:1人牙周膜干细胞分离、培养和鉴定牙齿标本是来自于在临床上因矫正需要而拔除的牙周健康的新鲜前磨牙(年龄在12~24岁之间),并经患者及其家属知情同意。用含1%双抗的pbs反复冲洗牙齿后,在牙根中1/3部位单向刮取牙周膜组织,用酶消化联合组织块法进行原代培养。将用i型胶原酶消化45分钟后的组织混悬液离心后接种于六孔板内,二天后第一次换液,之后每3天换液,收集获得牙周膜细胞,用流式细胞分选术得到pdlscs。在镜下通过观察细胞形态和它的克隆形成能力、采用流式细胞术分析其细胞表面标志物cd146、免疫组化法检测波形蛋白和角蛋白的表达以及对其进行成骨成脂诱导分化实验来鉴定其干细胞特性。3腺病毒转染用携带gli1特异性过表达的腺病毒感染pdlscs,westernblot检测pdlscs中gli1的表达情况。实验分为三组:即正常细胞对照组pdlscs/正常组、空腺病毒感染的pdlscs/空载组和由携带gli1特异性过表达腺病毒感染的pdlscs/gli1过表达组。4细胞应力加载分别取上述第4~6代三组细胞,接种于bioflex专用的板底为硅胶模的六孔板内培养。使用fx-4000t加载系统(达到国际标准化水平)以最大形变量12%,最小形变量为0的正弦波对三组细胞进行动态张应力的加载,频率为0.1hz(即5s拉伸5s放松),设定作用时间为0h(在同等条件下静置培养)、6h、12h、24h。收集细胞,提取蛋白,westernblot检测hh信号通路的相关效应蛋白gli1、ptch1和pdlscs成骨相关标志物runx2、alp的表达改变。结果:1、原代培养出的牙周膜细胞,镜下呈三角形或长梭形,梭形两端有的有突起和分叉,可与邻近细胞突起连接;通过流式细胞术分选所得pdlscs阳性率为94.8%(细胞抗体为cd146)。分选所得的pdlscs具有克隆形成能力;经免疫组化检测显示角蛋白表达阴性,波形蛋白阳性,表明其来源为间充质。pdlscs成脂诱导3周后,胞浆内可见脂滴,油红o染色阳性,成骨诱导3周后,镜下可见散在矿化结节,茜素红染色阳性,说明所得的pdlscs具有成骨、成脂等多向分化能力。2、westernblot检测转染过表达gli1腺病毒后的pdlscs中基因的gli1的转录水平变化,结果显示在转染48h后,gli1蛋白的表达量增加[灰度值(0.041±0.024)和(0.148±0.017),p<0.05],说明腺病毒载体能够有效的上调目的蛋白gli1的表达。3、对三组pdlscs进行同一加载方式和不同加载时间的应力加载后,提取蛋白,westernblot检测相关蛋白的表达,结果如下:(1)pdlscs/正常组加力后成骨相关标志物runx2和alp的表达较未加力时升高,说明在应力刺激下PDLSCs成骨分化的能力增强。(2)PDLSCs/正常组加力后检测Hh通路中的Ptch蛋白、下游的Gli1因子及ALP和Runx2的表达水平都比未加力时升高,并随着时间延长有所增加,说明Hh信号通路参与了PDLSCs应力成骨过程。(3)PDLSCs/正常组、PDLSCs/空载组和PDLSCs/Gli1过表达组加力后,Ptch、Gli1、Runx2和ALP的表达水平随着时间延长先升高后有所降低,只是增加的程度不同,在加力时间相同情况下,PDLSCs/Gli1过表达组Runx2和ALP的表达水平比PDLSCs/正常组明显,这表明Gli1具有促进PDLSCs应力成骨分化作用。结论:1:运用本课题组前期分离培养方法培养出来的人牙周膜干细胞被证实有克隆形成能力,高表达干细胞表面标志物,在特定诱导环境下具有多向分化潜能。证明此方法(酶消化联合组织块法)是有效可行的。2.过表达Gli1腺病毒感染PDLSCs后,减慢了PDLSCs增殖速率,而Gli1基因可以呈现稳定的高表达。3:细胞应力加载后的相关检测结果说明:PDLSCs的成骨能力随着加力时间增加先升高后有所降低。这表明PDLSCs在后期干性减弱甚至消失。特异性过表达Gli1的PDLSCs具有更强的成骨能力,证实了Gli1激活了Hh信号通路并对PDLSCs的成骨过程具有直接的调控作用。