iRoot BP Plus由硅酸钙、硫酸钙、氧化锆、氧化钽、磷酸氢钙和填料按一定比例组成,是一种预混即用的亲水纳米生物陶瓷材料,呈白色膏体状,遇水份固化,固化后不变色,纳米颗粒直径为10-50nm不等(Zhu L et al.2014)。iRoot BP Plus阻射性能高于牙本质和牙胶,在术中和术后均有良好的指引作用。具有不粘器械,操作性好,固化后体积稳定等特点,固化后与髓腔和根管壁结合紧密,封闭性好,受温度变化影响小,并且表现出良好的力学强度。临床操作中,医生不用考虑材料的调拌时间。iRoot BP Plus材质呈膏状能有效对抗手术中的冲洗,使充填过程更简单方便。同课题组成员前期研究了iRoot BP Plus的生物学特性,在体内体外模型中研究了其对牙髓干细胞的生物相容性和生物学活性(Zhu L et al.2014;Zhang J et al.2015),Ma(Ma J et al.2011;Zhou HM et al.2013)等细胞实验也证实iRoot BP Plus具有生物相容性,能促使牙龈成纤维细胞在其表面生长,Willershausen(Willershausen I et al.2013)的研究结果也表明iRoot BP Plus对成纤维细胞和成骨细胞具有生物相容性。本实验拟在此基础上,进一步研究iRoot BP Plus对巨噬细胞生物活性的影响,并通过比格犬动物模型对比研究其在直接盖髓术和牙髓血运重建中的应用,同时结合临床工作,随访观察了iRoot BP Plus应用于部分牙髓切断术。根尖周炎是最常见的牙科疾病之一,是主要由根管系统的微生物感染引起的根尖周组织炎症反应。宿主通过炎症细胞调控的免疫反应在根尖周炎症发展和转归中起重要作用,巨噬细胞则是根尖周炎症反应中最重要的免疫细胞。当根管内病原刺激的毒力很强,机体抵抗力较弱时,病变会以急性的形式表现出来;反之,如果机体抵抗力较强,而病源刺激较弱,或经过不彻底的治疗时,病变则呈慢性表现。慢性根尖周病变的特征是局部骨吸收和根尖周区域形成不完全愈合,如根尖肉芽肿和根尖囊肿组织。持续的微生物毒性因子刺激导致此区域免疫炎症细胞的聚集和活化,在这个过程中起关键作用的主要是多形核白细胞、巨噬细胞、T和B淋巴细胞,目前关于巨噬细胞在根尖周组织炎症反应中的作用的研究依然有限。在iRoot BP Plus对巨噬细胞生物学活性体外研究中,我们注意到IRF8可能参与调节巨噬细胞的功能,同时我们发现IRF8在人根尖周炎症组织中表达明显高于正常组织,因此进一步研究了IRF8在人根尖周炎中对巨噬细胞的调控作用和相关分子机制。本研究将有助于客观评价iRoot BP Plus在直接盖髓术、牙髓切断术和牙髓血运重建术中的应用以及探索相关机制;有助于揭示IRF8对根尖周组织炎症的调控作用和分子机制,对进一步阐明根尖周组织炎症机制具有重要意义。第一部分iRoot BP Plus在实验犬和人体内的应用目的:年轻恒牙在龋病、牙髓病或外伤等多种因素影响下,会导致牙髓意外暴露,不及时治疗会引起牙髓炎症和根尖周炎症甚至导致牙髓坏死,进而影响牙根继续发育。为了保留牙髓的活力,促进牙根继续发育,维持牙齿的各项功能,我们设计了iRoot BP Plus在实验犬和人体内应用的实验。本实验以MTA为对照,观察iRoot BP Plus直接盖髓于人为暴露的比格犬牙髓表面后,牙髓在组织学上的变化;观察iRoot BP Plus应用于比格犬牙髓血运重建后,根管内新生物的组织学特点;在临床上,随访观察人年轻恒牙使用iRoot BP Plus行部分牙髓切断术治疗后的效果。方法:(1)选取比格犬上下颌前牙,诱导全身麻醉后,口腔局部消毒,常规局麻下用直径为1毫米的高速球钻舌侧备洞,用15号K锉确认穿髓,无菌生理盐水棉球压迫止血,分别将iRoot BP Plus和调拌好的MTA置于穿髓孔上方,玻璃离子水门汀垫底,光固化树脂充填穿髓孔。三个月后HE染色观察牙髓组织的变化。(2)选取根尖孔未完全闭合的比格犬年轻恒牙,暴露牙髓法诱导产生根尖周炎,根管经过预备和彻底消毒后,刺激根尖出血,使血液充满根管形成血凝块,用iRoot BP Plus直接覆盖在血凝块上,建立年轻恒牙牙髓血运重建模型,MTA作为对照组。三个月后X线检查观察牙根发育状况,HE染色分析根管内新生组织形态特点。(3)选择年轻恒牙外伤露髓的病例27例,经患者和家属知情同意后,局麻下行部分牙髓切断术,将iRoot BP Plus覆盖在牙髓断面,树脂修复牙齿外形,定期随访观察牙齿发育状况。结果:在直接盖髓模型中,实验组和对照组根管内均没有发生牙髓坏死和根尖周炎,部分根管内含有炎症细胞。盖髓剂下方可见修复性牙本质形成,表面可见排列均匀的单层细胞,其下方为牙髓样组织,表现为血运较丰富的结缔组织,胶原纤维排列方式与正常牙髓一致,没有发现骨样和牙周膜样组织结构深入其中。在年轻恒牙牙髓血运重建模型中,实验组(7/10)和对照组(8/10)根管内可见到新组织再生,部分含有炎症细胞。新生硬组织主要表现为沿牙本质壁形成的牙本质样结构,部分根管内可见骨样组织,新生软组织为含有大量小血管的牙髓样疏松结缔组织,部分样本可见牙周膜样组织。在部分牙髓切断实验中,27例患牙一年期观察治疗成功率为100%。结论:未发生感染的牙髓暴露,使用iRoot BP Plus和MTA作为盖髓剂,均能通过直接盖髓术保护牙髓组织,两组材料无明显差别。在牙髓血运重建实验中,基于良好的感染控制,在牙根未发育完成的根尖周炎患牙中,使用iRoot BP Plus和MTA均能实现牙髓血管化再生,再生的组织与正常牙本质和牙髓结构类似,两组材料的差异性不明显。iRoot BP Plus应用于部分牙髓切断术治疗效果良好。第二部分iRoot BP Plus对巨噬细胞生物学行为影响的体外研究目的:iRoot BP Plus是一种预混即用型纳米生物陶瓷材料,作为根管修复或充填材料应用越来越广泛,根管充填材料在根管治疗过程中直接与发生炎症的根尖周组织相接触,充填材料势必和根尖周组织产生相互作用,炎症状态下iRoot BP Plus对巨噬细胞作用的影响尚未见报道。本研究的目的是评价iRoot BP Plus对巨噬细胞生物学行为的影响。方法:培养RAW264.7细胞,在无LPS刺激和LPS刺激条件下,将不同浓度的iRoot BP Plus材料浸提液加入培养基,置于37℃细胞恒温培养箱内孵育。使用CCK-8试剂盒检测巨噬细胞增值情况。DCFH-DA染色、流式细胞术检测细胞内活性氧聚集,免疫荧光染色观察巨噬细胞内IRF8表达水平的变化。结果:iRoot BP Plus浸提液对巨噬细胞的体外活性无影响。LPS显著提高细胞内活性氧水平,而iRoot BP Plus浸提液可降低正常对照组和LPS刺激组细胞内活性氧水平。LPS促进细胞内IRF8的表达,而iRoot BP Plus浸提液降低LPS的促进作用。结论:新型纳米生物陶瓷材料iRoot BP Plus在体外能够促进巨噬细胞的增殖,并降低巨噬细胞内活性氧水平,其机制可能与IRF8的调控有关。第三部分干扰素调节因子8在人根尖周炎中的表达目的:IRF8是人体固有免疫中重要的转录因子,它能调节骨髓细胞的发育和功能。人根尖周病损主要由根管内微生物感染引起,进而诱发根尖周免疫反应以清除感染。IRF8影响巨噬细胞活化和极化,而IRF8在人根尖周病损中的作用尚未明确。本实验旨在探索人根尖周病损标本中IRF8的表达及其与巨噬细胞、NF-κB信号通路和自噬途径的关系。方法:收集39例人根尖周组织,其中正常对照组15例,根尖囊肿11例,根尖肉芽肿13例。利用HE染色检测根尖周组织标本中炎症细胞的浸润情况。利用免疫组织化学方法检测各样本中IRF8的表达水平,并分析表达IRF8细胞占总细胞数的百分比。利用免疫荧光共定位检测IRF8分别与CD68阳性巨噬细胞、NF-κB、LC3的表达,并分析荧光共定位细胞的百分比。结果:在根尖囊肿和根尖肉芽肿样本中,IRF8的表达明显高于正常对照组。表达IRF8细胞在根尖囊肿中占58.65%,在根尖周肉芽肿中占64.74%,而在健康牙龈中占17.32%。免疫荧光检测提示IRF8在健康牙龈中主要表达在胞质部分,在血管内皮细胞中为胞核表达。而在病变组织中IRF8主要为胞核表达,主要表达于炎症细胞中,免疫荧光共定位显示在根尖周病损组中所有CD68阳性巨噬细胞均有IRF8阳性的核表达,且胞质表达明显多于健康对照组。根尖周炎组织中IRF8分别与NF-κB和LC3共定位表达均高于健康对照组。结论:IRF8在人根尖病变组织中表达明显增加,与病变组织中的巨噬细胞的形成成正相关,其机制可能与NF-κB和自噬程序有关,提示IRF8可能通过对炎性细胞的调控参与根尖周病变的发生发展。