研究背景：半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes, CysLTs)是一类重要的炎症介质,包括白三烯C4(leukotrienes C4, LTC4)、LTD4和LTE4。CysLTs通过半胱氨酰白三烯受体(cysteinyl leukotriene receptor, CysLT受体)起作用,包括CysLT1和CysLT2受体两种亚型。在外周,CysLT1受体参与多种炎症性疾病,如支气管哮喘、过敏性鼻炎等；CysLT2受体增加血管通透性,增强心肌缺血再灌注损伤。在中枢,大鼠局灶性脑缺血损伤后的脑组织,以及原代培养神经元和星形胶质细胞在缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation, OGD)后,CysLTs释放增加。局灶性脑缺血后,CysLT1和CysLT2受体表达显著上调,急性期(24h)主要分布在损伤的神经元,慢性期(3-28d)主要分布在激活的小胶质细胞及增生的星形胶质细胞,提示CysLT1和CysLT2受体介导急性期神经元损伤和慢性期小胶质细胞和星形胶质细胞增生。在细胞水平,CysLT1和CysLT2受体转染对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞缺血性损伤有不同调节作用,即转染CysLT1受体后对OGD敏感性降低,转染CysLT2受体后对OGD敏感性增加。然而,CysLT,和CysLT2受体是否介导缺血性神经损伤,尚待研究。在原代培养的大鼠皮层神经元,OGD能诱导神经元损伤,但CysLT受体激动剂LTD4并不诱导神经元损伤,不能证明整体实验的结果。因此,CysLTs很可能通过作用于神经元周围的细胞间接调节神经元损伤,例如,星形胶质细胞和小胶质细胞。我们已发现CysLT1和CysLT2受体在星形胶质细胞的不同调节作用,但对于它们如何调节小胶质细胞还有待研究。药理学研究表明,CysLT1受体选择性拮抗剂pranlukast和montelukast对大鼠、小鼠的局灶性和全脑缺血等损伤均有保护作用,可减轻神经元损伤、血脑屏障破坏、炎症反应、慢性脑损伤和胶质疤痕形成等。但是,montelukast不能减轻OGD诱导的神经元活性下降,仅能改善OGD后神经元形态变化。另一方面,长期缺乏CysLT2受体选择性拮抗剂,使得该受体在神经元缺血性损伤中的作用未得到充分研究。目前,已有CysLT2受体选择性激动剂N-methyl leukotriene C4(NMLTC4),以及CysLT2受体选择性拮抗剂Bay CysLT2和HAMI3379,为研究CysLT2受体提供了有用的工具。我们新近报道,HAMI3379对大鼠局灶性脑缺血有明显的保护作用,但其在细胞水平对脑缺血损伤的作用还需进一步研究。研究目的：本文拟较系统地研究CysLT,和CysLT2受体对OGD诱导的神经元缺血性损伤的调节作用,一是观察其直接作用,二是观察其通过胶质细胞激活的间接作用。具体解决以下四方面问题：(1)在大鼠原代神经元,两种受体是否直接调节缺血性损伤?(2)大鼠皮层混合细胞中,两种受体对缺血性损伤有何作用?(3)大鼠原代神经元-胶质细胞共培养中,两种受体对神经元缺血性损伤有何作用?(4)在大鼠原代小胶质细胞,两种受体对其吞噬功能、细胞因子释放有何作用?包括阐明其条件培养液对神经元损伤的影响。研究方法：在大鼠原代皮层神经元、皮层细胞混合培养、神经元-胶质细胞Transwell培养或小胶质细胞培养中,以缺氧缺糖(OGD)诱导缺血性损伤,以不同浓度非选择性激动剂LTD4或CysLT2受体选择性激动剂NMLTC4诱导损伤性变化；观察CysLT1受体选择性拮抗剂孟鲁斯特(montelukast)、CysLT2受体选择性拮抗剂HAMI3379的药理学效应。并以siRNA靶向沉默CysLT1受体表达,以慢病毒shRNA靶向沉默CysLT2受体表达。观察激动剂、拮抗剂及RNA干扰对OGD诱导的原代皮层神经元、皮层混合细胞、神经元-胶质细胞共培养的神经元损伤,或小胶质细胞激活及吞噬的影响。研究结果：第一部分CysLT1和CysLT2受体对皮层神经元OGD/R诱导损伤的影响首先,确定CysLTs是否通过其受体直接参与神经元缺血性损伤的调节。OGD时间依赖性诱导大鼠皮层神经元损伤,而非选择性激动剂LTD4、CysLT2受体激动剂NMLTC4不诱导神经元损伤。Montelukast可以减轻OGD/R (OGD1h,恢复24h)诱导的神经元损伤,表现为减轻神经元存活率下降、LDH释放以及坏死等；而HAMI3379则无这些作用。此外,经RT-PCR及WB证实,本研究采用的siRNA能成功抑制神经元CysLT1受体表达,慢病毒shRNA成功抑制CysLT2受体表达；但是,CysLT1受体siRNA和CysLT2受体shRNA均不能抑制神经元OGD/R损伤。这些结果提示,CysLTs及其受体并不直接参与调节神经元缺血性损伤,montelukast的抗脑缺血作用可能是一种非CysLT1受体依赖的作用。第二部分CysLT1和CysLT2受体对皮层细胞混合细胞OGD/R诱导损伤的影响为阐明在相对完整的细胞环境中CysLT受体的调节作用,我们观察了皮层细胞混合培养中的变化。OGD/R (OGD1h,恢复24h),LTD4, NMLTC4诱导细胞活性下降,LDH释放,细胞凋亡和坏死增加,小胶质细胞激活。CysLT2受体shRNA及CysLT2受体选择性拮抗剂HAMI3379可抑制细胞活性下降及LDH释放,减少坏死细胞数目,对凋亡没有明显影响。免疫荧光染色结果显示,细胞死亡以神经元死亡为主,星形胶质细胞和小胶质细胞死亡较少,CysLT2受体shRNA及HAMI3379可减少神经元死亡,抑制小胶质细胞激活。Montelukast可以减轻OGD/R或LTD4诱导的上述变化,但CysLT,受体siRNA却无此作用。上述结果提示,CysLT2受体介导皮层细胞混合培养中OGD诱导的神经元损伤和小胶质细胞激活,表明小胶质细胞激活与神经元损伤密切相关；但CysLT1受体不介导这些反应,montelukast可能通过非CysLT1受体依赖途径抑制神经元损伤和小胶质细胞激活。第三部分CysLT1和CysLT2受体对神经元-胶质共培养中OGD/R诱导神经元损伤的影响为进一步阐明小胶质细胞激活与神经元损伤的关系,我们观察了神经元-胶质细胞在Transwell共培养中的变化。在神经元-星形胶质细胞共培养中,OGD,LTD4, NMLTC4诱导神经元损伤,神经元数量减少,坏死细胞增多。而CysLT1受体siRNA、 montelukast、 CysLT2受体shRNA和HAMI3379对此均无明显作用。在神经元-小胶质细胞共培养中,OGD, LTD4, NMLTC4诱导神经元损伤,神经元数量减少,坏死细胞增多；这些变化可被CysLT2受体shRNA和HAMI3379减轻。Montelukast亦抑制OGD或LTD4诱导神经元-小胶质细胞共培养中神经元损伤,CysLT1受体siRNA对LTD4诱导的损伤也有部分抑制作用。上述结果提示,CysLT2受体通过小胶质细胞介导神经元损伤,并且,是一种主要调节途径。CysLT1受体部分通过小胶质细胞参与神经元损伤的调节；montelukast可能通过CysLT1受体依赖和非依赖途径抑制神经元损伤。但是,CysLT受体通过星形胶质细胞的调节作用尚待进一步研究。第四部分CysLT1和CysLT2受体对原代小胶质细胞OGD/R诱导的小胶质细胞激活,以及小胶质细胞条件培养液对神经元损伤的影响为阐明CysLT受体对小胶质细胞的调节作用,我们观察了原代培养大鼠小胶质细胞的变化。免疫荧光染色显示,静息状态下CysLT,和CysLT2受体表达较少,OGD/R(OGD1h,恢复24h)诱导CysLT1和CysLT2表达上调。CysLT2受体shRNA和HAMI3379可抑制OGD/R, LTD4, NMLTC4诱导的小胶质细胞激活、吞噬以及细胞因子TNF-α、IL-1β的释放。Montelukast可抑制OGD/R或LTD4诱导的小胶质细胞激活、吞噬；而CysLT1受体siRNA仅部分抑制细胞因子的释放。另一方面,OGD/R, LTD4, NMLTC4预处理的小胶质细胞培养液,可诱导神经元坏死；该变化可被HAMI3379和CysLT2受体shRNA抑制。Montelukast有减轻OGD/R和LTD4诱导神经元坏死的趋向；而CysLT1受体siRNA无此作用。这些结果提示,CysLT2受体作为主要因素通过调节小胶质细胞激活(增强吞噬以及细胞因子释放),进而介导神经元损伤。而CysLT1受体部分参与调节细胞因子释放；montelukast可能通过CysLT1受体依赖和非依赖途径介导神经元损伤。结论：1. CysLTs及其受体不直接参与OGD/R诱导的大鼠原代皮层神经元缺血性损伤。2.在大鼠皮层细胞混合培养中,CysLT2受体介导OGD/R诱导的神经元损伤和小胶质细胞激活；而CysLT1受体作用不明显。在神经元-胶质细胞共培养中,CysLT2受体作为主要因素通过调节小胶质细胞激活,介导OGD/R诱导的神经元损伤；CysLT1受体部分参与调节；CysLT受体对的星形胶质细胞作用尚待阐明。3. CysLT2受体可调节OGD/R诱导的小胶质细胞激活,通过增强吞噬及细胞因子释放,介导神经元损伤；CysLT1受体部分介导小胶质细胞细胞因子释放的效应。4. HAMI3379可拮抗CysLT2受体的效应；montelukast既有CysLT1受体非依赖的作用,也有CysLT1受体依赖的作用。它们均具有抗脑缺血损伤炎症效应的潜在价值。