全氟化合物（PFCs）是一类具有重要应用价值的有机化合物，因其具有优良的稳定性、表面活性、疏水疏脂等特性，被广泛应用于工业和民用领域。PFCs广泛分布在各种环境介质和生物体内，且具有难降解性和生物蓄积性，是一种新型持久性有机污染物（POPs）。近年来，PFCs对生态环境和人体健康带来的不利影响受到全球的普遍关注，成为环境科学和毒理学领域的研究热点。研究表明，PFCs能造成机体的内分泌系统发生紊乱，已成为环境内分泌干扰效应物（EDCs）筛检的重点。全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）是两种典型的PFCs，目前尚没有对其内分泌干扰活性的完整研究。国际上EDCs筛选程序中推荐采用体内（in vivo）和体外（in vitro）试验的组合测试法。本项目采用代表性PFCs（PFOA、PFOS）作为研究对象，通过体外成组方法筛选受试物的拟/抗雌激素受体（ER）、雄激素受体（AR）、甲状腺激素受体（TR）活性、过氧化物酶体增殖剂激活受体（PPAR）活性及对类固醇激素合成的影响，利用模式生物斑马鱼、SD大鼠，在体内水平研究PFOA、PFOS对机体内分泌系统的影响及作用机制，综合评价PFCs的内分泌干扰效应。第一部分体外试验筛选PFOA、PFOS的内分泌干扰活性第一节PFOA、PFOS对激素受体的干扰活性目的环境化合物可以通过受体介导途径发挥内分泌干扰效应，采用受体介导的报告基因试验体系，检测和评价PFOA、PFOS对雌激素受体（ER）、雄激素受体（AR）、甲状腺激素受体（TR）、过氧化物酶体增殖剂激活受体（PPAR）激动或拮抗作用。方法通过瞬时转染，将激素受体（ER、TR、PPAR）表达质粒、含有相应激素反应元件的荧光素酶（Luc）报告基因质粒，转染到激素受体阴性的CV-1细胞中，建立ER、TR、PPAR介导的报告基因试验方法，用来检测PFOA、PFOS的拟/抗雌激素、甲状腺激素、过氧化物酶体增殖剂激活受体活性；利用稳定转染雄激素反应原件报告基因的MDA-Kb2细胞来检测PFOA、PFOS的拟/抗雄激素活性。结果在ER介导的报告基因试验中，FPOA、PFOS单独作用，不能显著诱导报告基因Luc的表达；与1×10-9M E2共同作用，在受试浓度3×10-9-3×10-7M内可协同E2增强报告基因Luc的表达。在AR介导的报告基因试验中，未发现PFOA、PFOS对Luc有明显的诱导和抑制作用。在TR介导的报告基因试验中，PFOA（1×10-8-3×10-7M）、PFOS（1×10-7M、3×10-7M）能抑制5×10-9M T3诱导的Luc表达量。在PPAR介导的报告基因试验中，PFOA、PFOS在受试范围内表现出PPAR激动作用。结论PFOA、PFOS具有雌激素协同活性、抗甲状腺激素活性、PPAR激动活性。第二节PFOA、PFOS对类固醇激素合成的影响目的环境化合物可以通过非受体介导途径来发挥内分泌干扰效应，通过研究PFOA、PFOS对类固醇激素合成过程的影响，来评价它们的类固醇激素合成干扰效应。方法采用人肾上腺皮质瘤细胞H295R，检测PFOA、PFOS作用后对H295R细胞中类固醇激素（雌二醇和睾酮，即E2和T）水平、类固醇激素合成过程中关键酶基因及关键调控因子（SF-1）表达的影响。结果PFOA在1×10-8M及更高浓度时，增加细胞内E2的水平，在3×10-8M及以上，抑制T的水平。PFOS在3×10-8M及以上，增加E2的表达，在1×10-7M和3×10-7M浓度时，降低T的表达。PFOA、PFOS可以不同程度的改变类固醇合成过程中关键酶基因的表达。在10种与类固醇激素合成相关的基因中，PFOA作用后显著上调17βHSD1、3βHSD2、CYP11B2、CYP19的表达，下调CYP17、17βHSD4、CYP11A的表达。PFOS暴露后显著上调HMGR、StAR、CYP11A、CYP19、3βHSD2、CYP11B2的表达，下调CYP17、17βHSD1、CYP21的表达。PFOA暴露还可导致类固醇合成关键调控因子SF-1的基因和蛋白表达水平降低。结论PFOA、PFOS可以影响H295R细胞中类固醇激素的合成过程，具有类固醇激素合成干扰效应。第二部分体内试验研究PFOA、PFOS的内分泌干扰效应第一节PFOA、PFOS对斑马鱼胚胎发育的影响目的利用模式生物斑马鱼，研究PFOA、PFOS短期暴露对斑马鱼胚胎发育、内分泌相关基因以及整体基因表达的影响。方法受精后4h（4hpf）的斑马鱼胚胎，用100、200、500μg/L的PFOA、PFOS染毒至120hpf。观察斑马鱼胚胎/幼鱼的生长状况，包括胚胎死亡、孵化、生长发育、有无胚胎发育畸形等情况。检测120hpf的斑马鱼幼鱼体内内分泌相关基因（包括雌激素受体表达基因esr1、esr2b，甲状腺早期分化关键基因hhex、pax8，类固醇激素合成基因cyp19a、cyp19b、cyp17）的表达情况。在此基础上，进行单一浓度多暴露终点的斑马鱼胚胎暴露试验。选择500μg/L的PFOA、PFOS在斑马鱼4hpf-120hpf期间染毒，染毒至12hpf、24hpf、48hpf、72hpf、96hpf、120hpf，观察各时间点的胚胎发育情况，选取暴露至120hpf的斑马鱼幼鱼，利用斑马鱼表达谱芯片检测整体基因的表达情况，分析筛选出关键差异表达基因。结果在4hpf-120hpf染毒期间，受试浓度下的PFOA、PFOS对斑马鱼胚胎/幼鱼的生长发育没有产生明显影响，但可引起斑马鱼幼鱼内分泌相关基因的表达发生改变。与对照组相比，500μg/L的PFOA引起esr1基因水平的上调，对esr2b的表达无影响；200μg/L、500μg/L的PFOA能显著增加hhex、pax8的表达量；PFOA对类固醇合成酶相关基因的影响不大。在最高浓度下，PFOS暴露使esr1的表达量增加、esr2b的表达量降低；PFOS浓度依赖性的增加hhex和pax8的表达；200μg/L、500μg/L的PFOS暴露能显著抑制cyp19a、cyp19b、cyp17的表达。120hpf的斑马鱼表达谱芯片结果提示，多个通路上的多种基因在PFOS暴露后发生改变，差异表达基因主要参与到细胞过程、代谢过程、生物调控、发育等生物学过程。结论PFOA、PFOS暴露可对斑马鱼的基因表达产生影响，发挥潜在的干扰效应。第二节PFOA、PFOS对大鼠青春期发育的影响目的环境化合物暴露与青春期启动时间的异常密切相关。流行病学研究发现PFOA、PFOS的暴露和青春期启动的改变有关，但对其干扰青春期发育的相关机制一直未得到阐明。我们采用雌性大鼠模型，研究PFOA、PFOS在关键时间段暴露对雌性青春期启动和发育的影响，并探究其相关机制。方法采用SD雌性大鼠，在新生期（出生后1-5天，PND1-5）和青春前期（出生后26-30天，PND26-30）两个暴露阶段分别进行不同剂量的PFOA、PFOS（0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg）染毒。测定大鼠出生时、PND15、PND25、PND35、阴道开口日的体重和肛门-生殖器距离（AGD），记录雌鼠进入青春期的年龄（阴道开口时间）、首次发情期时间、雌性周期，检测血清雌激素和促黄体生成素（LH）的水平，计算卵巢系数，进行卵巢组织病理分析和卵泡计数。采用Q-RT-PCR分析下丘脑Kisspeptin/GPR54系统中Kiss1、Kiss1r、ERα、ERβ基因表达的变化，采用免疫组织化学方法检测kisspeptin蛋白表达水平，以探讨该系统在PFOA、PFOS所致的青春期启动时间改变中发挥的作用。选择染毒雌鼠的肝脏组织，测定肝脏系数，进行肝脏功能相关血生化指标的检测，采用GC-MS进行血清脂肪酸组、肝脏代谢组测定，以探讨PFOA、PFOS在发育关键期短期暴露对肝脏功能的影响。结果新生期、青春前期10mg/kg PFOA、1mg/kg和10mg/kg PFOS短期暴露，可引起雌鼠阴道开口时间比对照组早4-5天，提前进入青春期。新生期PFOA、PFOS暴露后，以非剂量依赖性的方式增加雌鼠体重和AGD；青春前期暴露也可增加雌鼠PND35的体重。在两个暴露阶段处理后，低、中剂量的PFOA、PFOS染毒组大鼠都能出现不规律的雌性周期，表现为延长的静止期或发情后期。PND1-5和PND26-30暴露于PFOA、PFOS的雌鼠血清雌激素和LH水平上升，新生期对激素的影响强于青春前期。化合物染毒未引起卵巢组织结构发生明显改变，但可影响卵泡数量，在新生期低剂量的PFOA、PFOS组大鼠可见生长卵泡数量减少。下丘脑前腹侧室周核（AVPV）和弓状核（ARC）区域Kiss1、Kiss1r、ERα的基因水平下降，免疫组化结果显示kisspeptin纤维密度在PFOA、PFOS的高剂量暴露组受到抑制，与基因表达的结果趋势大体相同。对于大鼠肝脏，高剂量组的PFOA、PFOS可以增加肝脏重量。GC-MS分析结果显示，血清中多种脂肪酸的含量发生改变，肝脏代谢小分子分析显示，PFOA、PFOS导致的差异表达物质主要集中在代谢通路、半乳糖代谢通路、脂肪酸合成通路等。结论新生期、青春前期短期暴露于环境剂量下的PFOA、PFOS能够影响下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的调控，导致雌性青春期启动的提前，其中kisspeptin/GPR54系统在其中起了关键作用。新生期暴露于PFOA、PFOS也可影响体内脂肪酸代