论文部分内容阅读
猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps),是猪呼吸道疾病综合症的主要病原菌,也是猪肺疫、副猪嗜血杆菌病、集体化猪场发病的常见病原菌之一,对养猪业带来了极大的影响,严重阻碍了养猪业的健康发展。因此,针对Pm与Hps研究快速检测的方法是成功防治的关键。本文以Pm与Hps为研究对象,建立了双重及多重PCR检测方法和LAMP检测方法。主要研究内容如下:(1)通过对猪多杀性巴氏杆菌与副猪嗜血杆菌保守序列设计引物,分别建立了猪多杀性巴氏杆菌与副猪嗜血杆菌环介导等温扩增的方法,并进行相应的特异性、灵敏性验证试验。结果显示,猪多杀性巴氏杆菌在环介导等温扩增方法中可以扩增出相应的特异性DNA片段,对其他相关病原菌都没有特异性的DNA扩增,最低检测限为85.2pg/?L,灵敏度比普通PCR高20倍。副猪嗜血杆菌在环介导等温扩增方中可以扩增出相应的特异性DNA片段,对其他相关病原菌都没有特异性的DNA扩增,最低检测限74.8pg/?L,灵敏度比普通PCR高20倍。反应均可在45min内完成。(2)根据GenBank中副猪嗜血杆菌16SrRNA、PILA、LIPO基因保守序列和猪多杀性巴氏杆菌16SrRNA、KMT1基因保守序列建立双重及多重PCR检测方法,通过对方法的优化、退火温度筛查,确定出最优退火温度,最后进行方法的验证。结果显示:副猪嗜血杆菌的PILA基因和LIPO基因双重PCR最佳退火温度为59.0℃,副猪嗜血杆菌16SrRNA基因和猪多杀性巴氏杆菌16SrRNA基因双重PCR最佳退火温度为55.0℃,KMT1、PILA、LIPO多重PCR最佳退火温度为58.0℃。对相关病原菌进行进行特异性扩增,均未扩增出任何目的条带,而Pm与Hps均能扩增出特异性条带,说明此方法的特异性较好。本研究分别针对猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌建立的两种快速检测方法,均有较高的特异性、灵敏性,并在较短时间内实现对病原菌进行快速准确的鉴别,为猪多杀性巴氏杆菌与副猪嗜血杆菌在临床上和基层实验室的快速检测提供一种新的技术手段。