FCD被认为是儿童药物难治性癫痫的主要病因,其特征是皮层结构的紊乱并伴有多种形态的细胞异常。针对FCD发生及其癫痫点燃机制,已经有多位学者提出了各种细胞和分子学机制,包括皮质发育阶段神经元的异常迁移和异常成熟,致痫灶中异常神经网络的形成等。近年来的研究提示FCD患者致痫灶中的DNs和BCs可能来源于室管膜前区的NPCs。另外,我们前期的研究提示在冷冻癫痫动物模型中,室管膜前区的NPCs参与局部微脑回的形成。然而,有关FCD皮质致痫灶中异型神经元的异常迁移机制仍未完全阐明。TRPC通道是非选择性钙离子蛋白,分为七个亚型,除了TRPC2以外,其余六种类型广泛分布于人脑的各个部位。根据氨基酸序列和功能的相似性,TRPC家族可以分为三组:TRPC1/4/5,TRPC3/6/7,and TRPC2。他们广泛表达于大脑组织中,被细胞内第二信使和G蛋白耦合受体激活并在中枢神经系统中发挥其生物学功能,例如:TRPC1表达于神经组织特别是胚胎发育时期,提示TRPC1可能参与神经元的早期发育和增殖;TRPC1在n e t r i n-1/B D N F调控神经元生长锥的生长方向方面发挥重要作用;TRPC1可以被谷氨酸受体激活参与兴奋性突触后电位的形成。另外,在TRPC1敲基因鼠中,74%的侧隔神经元的痫样放电被终止。而在TRPC1/TRPC4双重敲基因鼠的海马侧隔神经元中,由Pilocarpine诱导痫样放电极大增强。TRPC5参与神经元的增殖和分化,而异常的增殖和分化是FCD的病因之一。TRPC5可以抑制神经突的延伸,调控生长锥的形态发生。近期研究证实TRPC5可以调控神经元树突形成及大脑间联系。另外,在培养的海马神经元中,TRPC5通过激活下游因子CaMKK/Ca MKIγ促进轴突的形成,更为重要的是,Pilocarpine诱导颞叶癫痫动物模型中,TRPC5表达上调,在TRPC5敲基因鼠中,痫样发作次数减少,且由痫样发作引起的细胞凋亡同样减少,并证实了TRPC5参与痫样放电中的长时期电位形成。越来越多的研究表明TRPC6在神经元发育过程中发挥关键作用。例如:TRPC6与C3结合的异源组装体在BDNF调控神经元生长锥生长方向中发挥重要作用,提示TRPC6的激活可能参与神经元的迁移。神经网络的完善需要建立精确的神经元形态和突触连接。近来的研究证实TRPC6能够促进体内和体外培养的海马神经元的树突生长,此外,trpc6同时位于突触前和突触后区域,trpc6的表达上调诱导兴奋性突触连接。因此,trpc6可能参与神经网络的建立。综上所述,bdnf和trpc家族广泛参与神经元的早期发育和增殖,并在神经元迁移、神经网络建立等方面发挥重要作用,癫痫动物模型进一步证实trpc通道与癫痫点燃密切相关。因此,我们推测bdnf/trpc通路可能参与fcd病理发生和癫痫点燃过程。在本研究中,我们采用以下研究内容阐明bdnf/trpc通路在fcd中的作用及其可能的机制:1.利用realtime-pcr、westernblot、免疫组织化学技术检测bdnf和trpc在fcd临床标本中的表达分布情况;2.建立wt-fcd、trpc6-/--fcd和trpc6+/+-fcd模型小鼠,并通过egfp示踪svz区npcs,观察trpc6对svz区npcs迁移的影响,初步揭示bdnf/trpc通路参与fcd病理发生的相关机制。其主要结果如下:一、bdnf蛋白及其受体在fcd中的表达分布1、本部分实验从基因和蛋白水平证明bdnf表达于正常皮层,免疫组化结果表明bdnf主要分布于皮层锥体神经元和胶质样细胞;2、在fcd病灶皮层中,bdnfmrna和蛋白在fcd中的表达明显高于ctx标本,fcdiia和fcdiib组织中bdnfmrna和蛋白表达水平显著高于fcdia组织。进一步细胞定位研究提示bdnf中至高强度表达于灰质中的微柱样结构和白质中的异位神经元,胶质样细胞。高强度表达于dns和bcs。trkb蛋白表达水平较正常对照组织显著增高;但是,fcd病灶皮层中,p75蛋白表达水平较正常对照组织无显著性差异。3、以上结果提示bdnf可能参与维持异位神经元及dns和bcs等异型神经元的存活,通过诱导svz-npcs生长锥的生长方向参与fcd皮质致痫灶中dns和bcs形成,同时增高的bdnf可能增加癫痫易感性,bdnf通过结合trkb受体,而不是p75受体在fcd发生中发挥作用。二、trpc通道在fcd中的表达分布1、本部分实验从基因和蛋白水平证明trpc1、trpc5和trpc6表达于正常皮层,免疫组化结果表明trpc1、trpc5和trpc6主要分布于皮层神经元和胶质样细胞;2、在fcd病灶皮层中,trpc1、trpc5和trpc6mrna和蛋白在fcd中的表达明显高于ctx标本。进一步细胞定位研究证实trpc1、trpc5和trpc6高强度表达于微柱样结构,dns和bcs;荧光双标结果显示trpc1、trpc5和glutamate,gaba共表达于dns和bcs;大多数的trpc6阳性的神经元是谷氨酸能神经元,少量是gaba能神经元。3、以上结果证实trpc1、trpc5和trpc6可能参与fcd的癫痫点燃过程,trpc1、trpc5和trpc6的激活可能影响致痫灶中神经网络的兴奋性/抑制性平衡,进而引起癫痫发作;trpc1、trpc5阳性的胶质细胞与星形胶质细胞标记物gfap共标提示trpc1、trpc5可能参与星形胶质细胞诱发的痫性发作。trpc5激活钙离子内流,进而引起异常细胞(dns和bcs,异位神经元和星形胶质细胞)的兴奋性增高,进而诱发痫样放电。trpc6可能参与fcd病理发生过程;bdnf/trpc6通路可能通过调控神经元生长锥的生长方向参与dns、bcs和异位神经元的形成;bdnf/trpc6信号通路可能促进不成熟细胞(dns和bcs)的存活,这些不成熟细胞和成熟的拥有正常突触连接的细胞相互作用引起癫痫发作;trpc6在fcd皮质致痫灶中的表达上调可能通过camkiv-creb通路促进树突的生长,促进树突棘和兴奋性突触的形成,进而产生树突的异常生长和兴奋性神经网络的异常;这些发现提示fcd致痫灶中bdnf和trpc6的表达上调进而激活trpc6下游信号通路可能参与fcd的发生和癫痫点燃。三、trpc6调控svz区来源的npcs迁移的研究1、本部分实验采用冰冻方法制作冰冻损伤fcd动物模型,通过慢病毒为载体的trpc6rnai转染体外培养的svz-npcs制作trpc6-/-svz-npcs,并用egfp转染新生wt和trpc6+/+小鼠svz-npcs,成功制作wt-fcd、trpc6-/--fcd和trpc6+/+-fcd模型小鼠;2、通过在体示踪研究发现,在egfp注射后第5天,wt-fcd模型小鼠和trpc6-/--fcd模型小鼠中均未见明显迁移细胞,但是在trpc6+/+-fcd模型小鼠可观察到大量从svz区向微脑回区域延伸的egfp标记的绿色荧光的细胞,并形成丝带样细胞迁移流。egfp注射后第0天发现,wt-fcd模型小鼠中,可见少量从svz区向微脑回区域延伸的egfp标记的绿色荧光的细胞,trpc6-/--fcd模型小鼠中,可见散在的迁移细胞,且迁移方向较为紊乱;而在trpc6+/+-fcd模型小鼠中,可见从svz区向微脑回区域延伸的粗大的迁移细胞流(sfms)。3、以上结果提示trpc6表达上调可促进svz-npcs迁移,其机制可能是通过调控svz-npcs生长锥生长方向促进svz-npcs向皮质损伤灶迁移。综上所述,本研究结果表明:第一、bdnf和其高亲和性受体trkb在fcd患者组织中的表达明显增高,并且特异性地高表达在异构神经元的胞体和树突上,提示bdnf可能参与维持异位神经元及DNs和BCs等异型神经元的存活,通过诱导SVZ-NPCs生长锥的生长方向参与FCD皮质致痫灶中DNs和BCs形成,同时增高的BDNF可能增加癫痫易感性;第二、TRPC通道在FCD患者组织中表达上调,且在异构神经元上特征性地高表达,提示TRPC通道的激活可能影响致痫灶中神经网络的兴奋性/抑制性平衡,进而引起癫痫发作;BDNF/TRPC通路可能通过调控神经元生长锥的生长方向参与DNs、BCs和异位神经元的形成,并维持不成熟细胞(DNs和BCs)的存活,这些不成熟细胞和成熟的拥有正常突触连接的细胞相互作用引起癫痫发作;TRPC6在FCD皮质致痫灶中的表达上调可能通过Ca MKIV-CREB通路促进树突的生长,促进树突棘和兴奋性突触的形成,进而产生树突的异常生长和兴奋性神经网络的异常;第三、TRPC6表达上调可促进SVZ-NPCs迁移,其机制可能是通过调控SVZ-NPCs生长锥生长方向促进SVZ-NPCs向皮质损伤灶迁移。