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目的:尿路感染(Urinary tract infection,UTI)是一种常见的临床疾病,引起UTI的致病菌约70％～95％为尿路致病性大肠埃希菌(Uropathogenic.Escherichia coli,UPEC)。UPEC的临床分离株对抗菌药物多表现为多重耐药,给其感染的治疗带来一定困难,故研制疫苗用以预防UPEC感染具有重要的现实意义。本实验构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达载体,并研究尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因核酸疫苗产生的免疫反应及对小鼠的免疫保护作用,同时对本疫苗经不同免疫途径产生的免疫效果进行初步比较。
方法:
1.提取尿路致病性大肠埃希菌临床株基因组DNA,PCR扩增fimH基因片段,然后克隆到TA载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建peDNA3.0-fimH重组质粒。通过PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-fimH进行鉴定。
2.大量扩增并纯化质粒pcDNA3.0-fimH以免疫BABL/c小鼠。选取BALB/c小鼠40只,随机分为四组(PBS组、空质粒组、pcDNA3.0-fimH肌肉注射组、pcDNA3.0-fimH滴鼻组),使用本室构建的fimH基因的真核表达载体pcDNA3.0重组质粒分别通过肌肉注射和滴鼻(粘膜)2种途径免疫BALB/c小鼠,同时分别以载体质粒(pcDNA3.0)和PBS液为空质粒对照和空白对照,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,四组共连续免疫3次,检测小鼠血清中特异的IgG抗体。于末次免疫后第10天,以UPEC分离株菌液进行尿道上行攻击;攻击后第5天对小鼠及尿液进行细菌培养和计数(每只小鼠取尿液10μl接种于麦康凯平板。37℃培养24小时,第二天观察细菌菌落,进行菌落计数1。
结果:
1.pcDNA3.0-fimH重组质粒经PCR扩增获得了约910bp的片段:pcDNA3.0-fimH重组质粒经BamH I和x ho I双酶切后,产生了1个与fimH基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-fimH重组质粒的大片段,表明fimH基因已成功插入pcDNA3.0质粒中;测序获得的fimH DNA序列与GenBank登录的J96株fimH DNA的编码序列基本一致。表明成功构建了尿路致病性大肠埃希菌fimH基因真核表达载体peDNA3.0-fimH;。
2.将质粒免疫小鼠可诱导小鼠产生抗Ⅰ型菌毛抗体。免疫小鼠后,肌注组与滴鼻组小鼠血清特异性IgG抗体均明显升高,高于对照组及空质粒组(P＜0.05);
3.UPEC分离株菌液攻击小鼠后,进行小鼠尿液菌落计数,pcDNA3.0-fimH肌注组与滴鼻组小鼠尿液菌落计数明显少于对照组及空质粒组(P＜0.05)。
结论:
1.成功构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达质粒peDNA3.0-fimH:
2.动物实验结果表明,pcDNA3.0-fimH作为基因疫苗,可诱导BALB/c小鼠产生特异的体液免疫,对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用;不同的免疫途径免疫效果亦有不同。