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研究背景:多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）是一种慢性炎症导致的中枢神经系统脱髓鞘疾病。MS是青年人致残的主要因素。MS发病机制复杂,对其致病过程尚没有完全研究清楚,目前已经确定自身免疫过程在发病中起到关键作用。在环境因素、遗传因素和表观遗传因素的作用下,外周的免疫耐受被打破,自身反应性T细胞可能通过分子模拟、旁观者途径在外周免疫器官中激活和增殖,透过血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）进入中枢神经系统实质,对神经系统造成损伤。MS尚不能治愈,目前的治疗手段主要为急性期治疗、疾病修正治疗（Disease-modifying treatment,DMT）、对症治疗。大剂量甲泼尼龙（Methylprednisolone,MP）冲击治疗是急性期的主要治疗手段。复发缓解期的治疗以DMT为主,治疗目的为减缓疾病的症状和复发的频率。现在已经有十几种用于治疗复发缓解型MS的DMT药物,但是这些药物副作用较多,因此开发更多高效低毒的MS治疗药物是急需解决的问题。板蓝根是我国的传统药材,我们前期的研究从板蓝根中分离出一系列不饱和脂肪酸,并对其结构进行修饰,合成了一系列酰脲类化合物,这些化合物毒性很低,急毒性实验发现,一次性给予剂量5000mg/kg没有造成小鼠的异常。通过器官移植模型研究发现,这些化合物具有免疫抑制作用,能显著抑制淋巴细胞的增殖,延长移植物的存活期。根据MS的发病机理和这些化合物的作用机制,我们推测这些化合物对MS可能具有治疗作用。研究目的:利用实验性自身免疫脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）动物模型,研究N,N’-二环己基-N-亚油酸酰脲（N,N,-dicyclohexyl-N-linoleic acylurea,DCLAA）对人类MS的有效性和作用机制。研究方法:（1）安全性研究:小鼠分别给予腹腔注射30 mg/kg和60mg/kg的DCLAA,连续给药20天,观察动物的外观、行为、生理变化,检查主要脏器和肝肾功能的变化,检测脊髓中的细胞凋亡情况。（2）有效性研究:小鼠分为5组,分别为对照组、EAE组、EAE+DCLAA组、EAE+甲泼尼龙组、EAE+DCLAA+低剂量甲泼尼龙组,通过小鼠的临床评分和脊髓的脱髓鞘情况判断DCLAA的有效性。（3）DCLAA对淋巴细胞的作用机制研究:通过体内实验来研究DCLAA对小鼠中枢神经系统内CD4+T细胞、CD8+T细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞浸润的影响;对外周免疫器官的CD4+T细胞和CD8+T细胞数量的影响;对小鼠血液中肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNF-α）、干扰素γ（interferonγ,IFN-γ）、转化生长因子（Transforming growth factorβ,TGF-β）含量的影响;对小鼠脾脏细胞周期和细胞凋亡的影响。体外实验进一步研究DCLAA对淋巴细胞增殖、无能、细胞周期、细胞凋亡、细胞因子释放的影响。（4）DCLAA对小胶质细胞的作用机制研究:用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激BV-2细胞,建立小胶质细胞体外神经炎症模型;研究DCLAA对小胶质细胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和NO的释放影响;对细胞因子释放的影响,对小胶质细胞M1型和M2型活化的影响。研究结果:（1）安全性:给予小鼠30 mg/kg和60 mg/kg的DCLAA后,小鼠的外观、行为、生理都没有明显的异常;小鼠的心脏、肝脏、肾都没有明显异常;肝肾功能正常;脊髓中没有发现细胞凋亡。（2）有效性:DCLAA降低了EAE小鼠的临床评分,推迟了发病时间,显著降低了EAE小鼠的脱髓鞘。DCLAA与甲泼尼龙联合使用的协同作用效果不明显。（3）DCLAA对淋巴细胞作用机制:经DCLAA处理的EAE小鼠,其中枢神经系统内的CD4+、CD8+T细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞的浸润显著减少;血液和脾脏中的CD4+和CD8+T细胞数量显著下降,血液中促炎细胞因子TNF-α浓度显著下降;IFN-γ的浓度上升,但无统计学差异;抗炎细胞因子TGF-β的含量显著上升;脾脏组织的抗凋亡蛋白BCL 2显著下降,促凋亡蛋白BAX显著上升,细胞周期相关蛋白Cyclin E和CDK 2表达显著下降。体外实验结果发现,经过DCLAA处理的淋巴细胞,随着DCLAA浓度的增加,其细胞周期被阻滞于G1期,细胞增殖受到抑制;线粒体膜电位下降,细胞凋亡增加;促炎细胞因子IFN-γ和抗炎细胞因子TGF-β的释放都增加。转录组测序结果也显示,DCLAA对淋巴细胞的增殖和存活具有显著影响。同时,体内和体外实验都发现,DCLAA处理后PI3K和p-Akt基因表达水平显著降低。（4）DCLAA对小胶质细胞的作用机制:LPS刺激BV-2细胞后,细胞的ROS和NO释放量都显著增加;促炎细胞因子TNF-α显著上升,抗炎细胞因子白细胞介素（Interleukin,IL）10显著下降;M1型活化标志物诱导型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase,i NOS）的表达量显著上升,M2型活化标志物精氨酸酶（Arginase）1的表达量显著下降;但是DCLAA对LPS诱导的BV-2细胞活化具有抑制作用。用DCLAA先于LPS2个小时处理BV-2细胞,以上的炎症因子表达量都下降了,而Arg-1的表达增加;同时,TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白TLR4和p-IκBα的表达显著下降。经过DCLAA治疗的EAE小鼠,其脊髓组织中的促炎细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-1β）的表达水平显著下降,脑和脊髓中的M1型标志物CD86和CD16的表达水平也显著下降。结论:DCLAA通过PI3K-Akt信号通路抑制淋巴细胞的增殖,促进淋巴细胞的凋亡,减少了外周淋巴细胞向中枢神经系统的浸润,并且通过TLR4/NF-κB信号通路减轻小胶质细胞的神经炎症反应,从而抑制了EAE的进展。本研究可以为MS治疗药物的开发提供理论依据。