TCR-T和CAR-T细胞作为一种新型细胞药物,当前已在肿瘤过继免疫治疗（adoptive cell therapy,ACT）临床试验中大量应用。其在体外对患者T细胞进行基因修饰,使之成为具有新特性功能的自体细胞药物,再回输至患者体内,从而实现对肿瘤细胞的特异性杀伤。然而,这种治疗方式在发挥作用的同时可能出现不良反应,目前临床已经观察到TCR-T和CAR-T在治疗过程中可能会出现细胞因子风暴、非肿瘤靶向的脱靶效应等不良反应。同时由于细胞药物在体内具有增殖能力,不像传统治疗药物在体内会被代谢降解,因此其在体内发生不良反应的程度不可预估。如果细胞药物在人体内具有人为可控的自杀基因安全开关,则无疑加大了其在临床使用中的安全性与可控性。HSV-TK是一种单纯疱疹病毒型胸苷激酶,前药更昔洛韦（ganciclovir,GCV）与之结合后产生的三磷酸产物可抑制细胞DNA复制,从而诱导细胞凋亡,可作为自杀基因。但HSV-TK完全发挥作用时间较长,需72 h,且药物GCV使用存在局限性。同时,HSV-TK是一种胞内蛋白,将其导入细胞后无法直接对阳性细胞进行筛选,因此需要共同连接一个胞外蛋白作为筛选标记。RQR8是一个人工合成的含CD34和CD20模拟表位的跨膜蛋白小分子,其既含有可被临床CD34分选系统识别的筛选标记,又含有可被临床药物利妥昔单抗（rituximab,RTX）靶向结合的CD20膜蛋白自杀分子,后者通过补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity,CDC）导致CD20⁺细胞死亡。CD20自杀系统最快仅需2 h就可发挥作用,但治疗效果受到患者体内补体状态的影响。HSV-TK与CD20通过不同的途径实现细胞自我清除,可在作用时间及作用方式上形成互补,因此本研究提出通过T2A连接肽将RQR8与HSV-TK相连接,构建pLV-RQR8-T2A-TK共表达慢病毒质粒,建立可供CD34筛选的HSV-TK、CD20双自杀基因系统,并在T淋巴肿瘤细胞株Jurkat及人外周血T细胞中验证该系统的筛选、自我清除功能。本实验利用无缝连接技术构建pLV-RQR8-T2A-TK慢病毒共表达质粒,通过酶切、测序进一步验证外源插入片段序列正确。通过慢病毒包装技术获得LV-RQR8-T2A-TK慢病毒液,利用该病毒感染Jurkat细胞及T细胞,流式荧光抗CD34单抗检测RQR8中CD34表位表达情况并进行磁珠分选,CD34磁珠分选后RQR8⁺TK⁺Jurkat细胞纯度可达99.4%,RQR8⁺TK⁺T细胞纯度达92.46%。RQR8中CD34表位可作为筛选位点发挥分选作用,T2A作为连接肽并未对其表达产生影响。向两种细胞中加入利妥昔单抗,作用20 h后流式细胞仪检测活细胞数量。结果显示,当利妥昔单抗浓度增加为30、90、180μg/ml后,细胞存活率显著低于对照组（P<0.05）,且呈现剂量依赖性。利妥昔单抗可通过CDC作用导致RQR8⁺细胞凋亡,证明RQR8中CD20表位表达正常,RQR8功能完整。两种细胞加入GCV作用72 h后,CCK-8检测结果显示,GCV可显著抑制RQR8⁺TK⁺Jurkat细胞与RQR8⁺TK⁺T细胞的增殖,GCV对RQR8⁺TK⁺Jurkat细胞和RQR8⁺TK⁺T细胞的IC₅₀分别为20.66μM和2.14μM。Annexin-V/PI双染色法对细胞凋亡情况检测显示,加入GCV作用72 h后,RQR8⁺TK⁺Jurkat细胞和RQR8⁺TK⁺T细胞的凋亡率显著高于对照组,两组细胞实验结果均与对照组有显著性差异（P<0.01）。证明HSV-TK表达正常,T2A对HSV-TK的功能并未产生影响。本研究成功构建含HSV-TK/CD20双自杀基因的pLV-RQR8-T2A-TK慢病毒共表达质粒,RQR8中CD34单抗表位成功表达并可作为筛选标记用于阳性克隆分选,可保证临床输入的细胞药物均为含双自杀质粒的阳性细胞,提高临床安全性。可控的HSV-TK/CD20双自杀基因系统可在人外周血T细胞中发挥作用,两种自杀基因通过不同途径使T细胞实现自我清除,互为补充,可为临床消除过继免疫治疗不良反应提供多种选择手段,从而进一步保证治疗的可控性。