曲霉是自然界中广泛存在的真菌，是引起免疫抑制患者严重的深部曲霉感染的主要病原菌。因为恶性肿瘤、粒细胞减少或功能障碍、糖皮质类固醇、免疫抑制剂的使用等原因造成的患者免疫功能缺陷，是侵袭性曲霉病(IA)发病的高危因素，这些患者吸入烟曲霉孢子后，孢子可以从气管肺泡中侵入肺部造成初发的侵袭性感染，并常伴远隔器官的转移。近10年来，IA发病率不断上升，并成为免疫抑制患者死亡的主要原因之一。IA病死率可达到100％，造成这种高死亡率的原因之一是很难在IA的早期确定诊断，因此使有效的抗真菌治疗受到延误。有研究表明，在疾病早期进行诊断和治疗可以降低病死率。IA诊断困难主要因为其临床表现缺乏特征性，传统的真菌培养法和组织病理方法不能满足早期诊断的要求，因此需要建立新的、快速、高效的方法提高IA的诊断水平。其中，曲霉抗原和DNA检测因其快速、灵敏、特异性好引起了研究者的关注。 已有的血清学方法中，抗体检测方法的应用因患者存在免疫抑制，使抗体水平不能反映患者的感染情况而受到限制。循环中抗原检测方法虽然有优势，但由于方法学的不足未得到广泛开展。最近出现的半乳甘露聚糖(GM)检测的ELISA方法，利用大鼠单克隆抗体EB-A2检测曲霉属细胞壁特异性抗原GM，具有更好的灵敏性。 分子生物学技术的发展为病原微生物的检测开辟了广阔的前景，核酸扩增和杂交是这些检测方法的基本技术之一，PCR因为能扩增检测标本中极微量的细胞DNA而被广泛使用，扩增产物往往通过电泳、Southern blotting、PCR-EIA等方法检测。原位杂交则不需要DNA的提取，可以在组织标本原位中显示病原菌的存在。 这些新方法的发展和应用使得IA的早期诊断在近几年得到了长足进步，但是各研究报道的结果不完全一致，对这些方法的评价也不同。为进一步评价曲霉GM的ELISA检测和曲霉DNA PCR-种特异性探针的检测对IA诊断的意义，我们进行了如下研究：建立IA动物模型，用该方法检测血清和组织标本中的GM或真菌DNA，并探讨相关影响因素。同时收集健康人血清40例和器官移植、长期应用糖皮质激素、免疫抑制剂等免疫抑制患者的血清39例，进行ELISA和PCR-种特异性探针检测，并对病理证实IA感染的临床尸检和活检组织标本共39例进行PCR-种特异性探针检测。通过对以上临床标本的检测，评价这些实验室检测方法的临床价值。第三军医大学博士学位 在动物实验中，对24只日本大耳白兔肌肉注封地塞米松进行免疫抑制，然后静脉接种烟曲霉抱子。在接种前和接种后24h、48h、万2h和%h分别取血清进行检测，血清ELisA检测可以在动物感染后24h检测到阳J性结果，该方法的敏感性和特异性分别为95%和78，9%。通过玻璃珠高频振荡法提取血清标本的真菌DNA，用一对真菌通用引物进行PCR扩增，产物用4种常见的种特异性探针:烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉探针进行斑点杂交，敏感性为80%，特异性为95.8%。血培养阳性率仅为5%。曲霉饱子接种后24h、48h、72h和96h分批处死务解剖动物，部分内脏组织匀浆后接种于SDA培养基，进行真菌学培养和CFU计数，结果显示血清中GM含量与病情发展一致。部分组织用福尔马林固定，石蜡包埋并切片，切片中提取的真菌DNA进行PCR一种特异性探针检测，敏感性和特异性分别为巧%和100%。动物组织标本的原位杂交结果显示6例标本均阳性，2例对照阴性。 将动物实验建立的方法用于临床标本。对侵袭性曲霉感染的高危人群进行EUSA检测，检测到阳性血清12，8%，健康人群中阴性血清为95%;PCR一探针杂交法为1 2.8%和97.5%。对组织病理证实的石蜡包埋组织的PCI卜探针杂交检测敏感性为66.7%，特异性为100%。 我们还建立了IA兔抗真菌药物静脉注射治疗模型，动物在接种烟曲霉后24h分别给予两性霉素B lmg瓜g·d、伊曲康哇巧mg瓜g或氟康哇20m叭g·d，给药5天后，检测治疗各组血清GM含量并与真菌负荷量和病死率比较，结果显示GM的水平与动物抗真菌治疗过程的病情变化一致。 上述研究表明，血清ELISA方法和PCR一探针杂交法可以快速高效的诊断动物的IA，动物实验显示其阳性率显著高于血培养的阳性率。血清GM抗原动态监测可以作为评价IA病情严重程度和抗真菌药物的疗效的指标之一。临床研究显示血清ELISA方法和PCR一探针杂交法可以用于对IA高危患者的监测。PCR一探针杂交在诊断的同时还可以鉴定曲霉到种。原位杂交法和PCR一探针杂交可用于石蜡包埋组织的诊断和回顾性研究。