论文部分内容阅读
血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）是肾素—血管紧张素系统（RAS）的重要生物活性肽。近年来，尽管研究证实AngⅡ能通过促进血管平滑肌细胞增殖；增加白细胞粘附；刺激纤溶酶原激活物抑制物—1、内皮素—1和粘附分子的产生和释放；促进细胞凋亡等方面影响动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的形成，但其分子机理仍未完全明了。 AngⅡ调节的绝大部分心血管效应都是通过AT1受体完成。目前，AT1受体拮抗剂（ARB）作为主要的降血压药物之一，已广泛地应用于临床。研究发现ARB具有抗AS作用，但其作用机制，至今仍不明确。 在AS形成和发展过程中，内皮细胞受损、泡沫细胞形成和粥样斑块的稳定性都与氧化低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，Ox-LDL）密切相关。Ox-LDL是通过清道夫受体（Scavenger Receptor，SR）而被细胞摄取的。血凝素样氧化低密度脂蛋白受体（LOX-1）是1997年新发现的主要存在于内皮细胞上的SR，与其它在巨噬细胞上发现的SR无任何同源性。LOX-1为Ⅱ型膜表面糖蛋白，属于C型血凝素家族，能结合、内吞并降解 浙江大学博士学位论文 Ox－LDL，介导了OxLDL对内皮细胞的损伤。进一步的研究发现，巨噬细胞和血管平滑肌 细胞（VSMC）膜上亦有LOX－l表达。动脉AS病变标本的兔疫组化分析表明，病变处VEC、 VSMC和巨噬细胞表面LOX－l受体均上调。体外实验发现，OxpL本勇和一些炎性因子 可诱导LOX－l表达。提示LOX－l在AS的形成中可能占有重要地位。 本课题通过研究Angl对人脐静脉内皮细胞（HUVECS）和巨噬细胞（TIll，－l细胞）LOX－l 蛋白表达和基因转录的影响，以及 Afig 111型受体桔抗剂绥沙坦（ValS8fl：3II）对此的拈抗作 用，以期从细胞蛋白和分子水平探讨Aodl和不同细胞LOX－l相互之间的关系，以及对AS 形成、发展的意义，并为深人了解VatS8fl8ll抗AS的作用机理，和指导临床应用提供理论依 B。 第一部分 血管紧张素11对人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化 低密度脂蛋白受体的影响以及濒沙坦的桔抗作用 研究目的：本部分研究在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）水平上，探讨 Angll对 HMC LOX－1蛋白表达和基因转录的影响以及Vl的桔抗作用，以期深入了解Aedl和 Vlsartan对内皮细胞LOX－l的作用，从而揭示Angl和内皮细胞oX－l相互之间的关系和 在动脉粥样硬化中的地位，以及Vlsartan可能的抗＾S作用机理。1 方法： 1．药物的细胞毒性试验 2．翩分组 门)对照组：培养基Q)Angl组：分别加人10“～10－‘’m。凡的Afigl 作用24 ’J’时；以及10“molll．的Aodl 作用不同时间（0、3、6、12、24、36、48h）。 二 浙江大学博士学位论文 u)Vaisartan＋Angll组：分别加人 10”’～10’moljL的 Vaisaltall预作用半小时后，再 加人Aodl （沪mollLL24小时后收获。＊）Vaisartan组：加人10“moto的Visahan 作用24小时。 3．用细胞酶联免疫法和半定量RTPCR分别检测LOX－l蛋白和InRNA表达的情况。 结果： 1．细胞毒性试验结果显示，低于 10“M浓度的 Angll、Valsartan和 Angll＋Vasartan对 HUVEC生长无任何毒性，细胞存活率大于96％； 2．最适循环数实验结果显示，p－aCtin在18－26个循环之间、IjZX刁在M－36个循环之间 cDNA量是处于指数增加期，而后就进入平台期，故取25个循环和35个循环分别作为 p－aCtin和 LOx－l的PcR循环数。 3．不同浓度的Allgl（l“’～10m mollL）加入HUVECs的培养液中作用24 ，J’时后，Ws 细胞表面LOX－l蛋白表达量随着Atall的浓度增加而显著增加（与对照组相比，P均t 0．00！）。Aedl为10””、10｛、IO毛、10”’、！0一、10占mo凡时，光密度值（OD4扣）分别 为 0．228士0．024、0．220士0．020、0．339士0．044、0．580士0．079、1．061士0．043、1．276士 O．115，对照组为0．148士0．008；显示以上浓度的Atall使HUVECS细胞表面LOX刁蛋 白表达量分别为对照组的l．54士0．16、l．49士0．14、2．29土0．30、3．92士0．53、7．17士0．29、 82士0．78倍：其中＊呛n浓度为10“’～1沪m＊几时，相邻浓度间比较LOx1表达均 有显著差异（Prto．05或 0．001），提示 LOX．l表达增加呈浓度依赖性。10”” moljL浓度 的A则！作用结果与10一一IlL浓度的A则I作用结果之间无显著差异(P hho．os入 4．将细胞孵