论文部分内容阅读
【研究背景】目前恶性胶质瘤的治疗仍然面临巨大挑战,寻找比传统治疗更有效的治疗手段一直备受各国神经科学工作者的关注。血管生成不仅在个体发育、损伤修复、组织再生等生理过程中扮演重要角色,同时它也是肿瘤生长和转移过程中的一个重要步骤。由于肿瘤内皮细胞遗传上稳定,不易产生耐药,抗肿瘤血管生成治疗已成为肿瘤治疗领域很有前途的治疗方法之一。目前已有多种抑制新生血管生成的药物用于抗肿瘤研究。肿瘤抑素（Tumstatin）是继血管生成抑素（Angiostatin）和内皮抑素（Endostatin）之后,新发现的源于血管基膜Ⅳ型胶原α3链的内源性血管生成抑制因子,具有明显的抑制肿瘤血管生成和诱导其内皮细胞调亡的活性。由于采用血管生成抑制因子直接投药的方式治疗肿瘤存在所需剂量过大,同时生产有完整活性的血管生成抑制因子存在技术困难,因此通过基因转染的方法提供有完整生物活性的血管生成抑制因子在体内持续、较高浓度的表达,是肿瘤抗血管生成治疗的理想策略。利用全长Tumstatin片段抑制胶质瘤血管生成的基因治疗实验目前国内外尚未见报导;故本课题试图克隆人Tumstatin基因,构建其真核细胞表达载体（pcDNA3.1-Tumstatin）;观察Tumstatin体外抗血管生成的生物活性及了解此基因转染对U251胶质瘤细胞株的自身增殖有无影响,并观察Tumstatin在肿瘤局部持续、较高浓度表达对U251裸鼠移植瘤生长有无抑制作用,探讨Tumstatin基因治疗胶质瘤的可行性。目的构建抗血管生成的人肿瘤抑素（Tumstatin）基因真核表达载体,为后续体外Tumstatin转染U251细胞及其在荷瘤裸鼠（BALB/N）的体内表达创造条件。方法1、从HEK293细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Tumstatin基因。2、将该基因导入克隆载体pUC57-T中,转化大肠杆菌DH5α进行扩增,并提取纯化,对所获重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列分析鉴定。3、用内切酶NheI和NotI对重组质粒pUC57-Tumstatin双酶切,并纯化目的基因片段,同时用内切酶NheI和NotI对质粒pcDNA3.1（-）进行双酶切。取纯化的目的基因片段与表达载体pcDNA3.1（-）在T4连接酶的作用下进行连接反应。经菌落PCR、酶切鉴定和DNA测序证实后,制备和纯化重组质粒。结果1、提取的RNA经电泳有明显的28S、18S、5S三条带,分光光度法测得A260/A280=1.8933,提示RNA无明显降解;RT-PCR产物电泳显示在750bp处有一特异性条带。2、重组质粒pUC57-TumstatinDNA测序结果显示插入的目的基因与GenBank收录的人Tumstatin基因cDNA序列完全一致,无任何突变。3、重组质粒pcDNA3.1-Tumstatin经酶切鉴定后,DNA序列分析结果与GenBank收录的人Tumstatin基因cDNA序列亦完全一致,无任何突变。分光光度法测得此重组质粒溶液A260/A280=1.823。结论成功克隆了人Tumstatin基因并构建了Tumstatin基因的真核表达载体pcDNA3.1-Tumstatin。目的观察血管生成抑制因子Tumstatin体外抗血管生成的生物功能及了解此基因转染对于U251胶质瘤细胞株的自身增殖有无影响。方法以脂质体法将分泌型真核表达载体pcDNA3.1-Tumstatin转染至人胶质瘤细胞株U251,并用G418筛选出稳定转染的细胞株,观察转染后的U251细胞的生物学特性（MTT法观察U251细胞株的增殖活性、流式细胞仪检测其细胞周期）,并以Western blot检测培养上清中Tumstatin的分泌表达,进一步提取U251细胞的培养上清液,加至脐静脉内皮细胞（HUVECs）的培养液中,采用MTT法观察HUVECs的增殖活性、细胞划痕法检测其迁移能力、体外管腔形成抑制实验检测其成管能力及流式早期细胞凋亡检测法检测HUVECs的早期细胞凋亡率。结果1、成功获得可表达Tumstatin的U251细胞株,转染组U251细胞的增殖活性及细胞周期与未转染组的无显著差别（P＞0.05）;2、Tumstatin在体外不能抑制HUVECs的迁移,但它能显著抑制HUVECs的增殖,诱导HUVECs细胞凋亡及抑制其形成毛细血管的能力。结论Tumstatin基因转染对U251细胞自身增殖无显著影响,Tumstatin在体外有较强的抗血管生成的活性。目的探讨Tumstatin抑制U251裸鼠移植瘤生长的作用。方法BALB/N裸鼠随机分成三组,每组10只,然后将未转染的U251细胞株及pcDNA3.1-Tumstatin稳定转染和pcDNA3.1稳定转染的U251细胞株各分别以1×107/只接种裸鼠。成瘤后每隔一周测量移植瘤体积一次,于接种后第28天处死裸鼠,将获取的移植瘤标本称重后,做肿瘤切片HE染色、TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡、CD31免疫组化检测MVD。结果1、pcDNA3.1-Tumstatin组移植瘤的平均体积及瘤重都比pcDNA3.1组及未转染组低（p＜0.05）。2、肿瘤切片HE染色三组无明显区别,但pcDNA3.1-Tumstatin组肿瘤细胞平均凋亡率比其它两组高（26.60±2.02 vs.11.21±1.57,9.69±0.86,P＜0.05）,同时微血管密度（MVD）比其它两组低（5.62±1.32 vs.23.84±1.71,29.33±4.45,P＜0.05）。结论人Tumstatin有抑制U251移植瘤生长的作用,通过抑制肿瘤血管生成而间接诱发肿瘤细胞凋亡可能是其主要机制。