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脑血管疾病目前仍是危害人类健康的常见疾病之一,其发病率高,并具有较高致残率和死亡率。其病理生理机制尚未完全明确,临床药物治疗效果均不理想。近年来临床采用包括药物溶栓及介入溶栓等治疗方法,可使闭塞的脑血管再通,缺血脑组织及时得到血运恢复(再灌注),挽救了大批濒临死亡的脑细胞。但研究也发现,再通后血流的再灌注却常使缺血组织的病理损害进一步加重,甚至进展为不可逆损伤,临床症状恶化,这种现象被称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury. CIRI)。CIRI机制非常复杂,已经提出了多种假说。近年研究表明,与再灌注有关的急性炎症反应是引起缺血再灌注损伤的关键因素。在人类,已经证实,致炎细胞因子的增加与脑缺血性梗死以及中风后预后极差有关,炎症标记物可以作为缺血性中风的独立预测物。实验研究表明,抗炎治疗可以减轻缺血组织损伤,但脑缺血再灌注损伤后炎症反应发生的根源和机制仍不明确。Toll样受体4(TLR4)是体内介导内源性免疫反应的重要受体,研究表明,TLR4参与了脑缺血再灌注损伤过程,TLR4基因敲除的小鼠缺血再灌注损伤引起的脑梗死面积可显著降低,脑内或循环内炎症因子等表达也显著降低。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)通过AT1受体介导的炎症反应在CIR的病理过程中也起了重要作用。本研究主要探讨脑缺血再灌注损伤对TLR4表达的影响.及其与肾素-血管紧张素系统的关系,以充实完善缺血性脑损伤的病理生理机制,为缺血性脑血管疾病的药物治疗提供新的作用靶点,并为研究和开发新作用靶点的药物提供实验依据。本研究包括在体实验和细胞实验两大部分：一、在体实验部分研究方法：采用栓线法大脑中动脉阻塞(MCAO)方法造成大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,采用神经功能学评分评价动物神经功能缺损症状,采用2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC)染色技术,观察脑组织中梗死灶的面积,以评价模型的建立情况,以及动物提前给予卡托普利(15mg’kg, bid,灌胃14d)、氯沙坦(10mg/kg, qd,灌胃14d)和辛伐他汀(20mg/kg, qd,灌胃14d)对脑缺血再灌注损伤的保护作用。采用RT-PCR,免疫组化技术,研究脑缺血再灌注损伤后TLR4 mRNA和蛋白表达变化情况,以及卡托普利、氯沙坦、辛伐他汀等药物的影响。实验结果：缺血再灌注损伤可以引起大鼠神经功能缺陷,TTC染色显示脑组织存在明显梗死灶。卡托普利、氯沙坦、辛伐他汀对IR引起的脑损伤具有保护作用,表现为大鼠神经功能评分改善,梗死面积减少。RT-PCR研究表明,IR损伤后,缺血区皮层和海马组织内TLR4 mRNA表达均显著增加。免疫组化研究表明,IR可引起脑组织内TLR4阳性细胞明显增加。卡托普利、氯沙坦、辛伐他汀对TLR4 mRNA和蛋白表达均具有抑制作用。结论：1.脑缺血再灌注损伤可以诱导脑组织内TLR4 mRNA和蛋白表达增加。2.卡托普利、氯沙坦和辛伐他汀对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用。3.卡托普利和氯沙坦可以抑制脑缺血再灌注损伤所致的TLR4表达增加,说明AngⅡ参与了脑缺血再灌注损伤所诱导的TLR4表达,卡托普利和氯沙坦对大鼠CIRI保护作用机制之一是通过抑制脑内TLR4表达。4.辛伐他汀可以抑制脑缺血再灌注损伤所致的TLR4表达增加,辛伐他汀对大鼠CIRI保护作用机制之一是通过抑制脑内TLR4表达。二、体外实验部分研究方法：在体外培养的小胶质细胞细胞株BV-2,采用缺氧/复氧模拟体内缺血再灌注损伤模型。通过MTT法测定细胞存活率和细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)反应细胞受损情况,通过RT-PCR. Western Blot技术研究缺氧/复氧所致细胞TLR4 mRNA和蛋白表达变化,并通过AngⅡ/AngⅡAT1受体阻断剂氯沙坦和AT2受体阻断剂PD123319的作用,研究AngⅡ对缺氧/复氧所致TLR4表达的影响及其受体机制。同时单独采用AngⅡ处理正常培养的BV-2细胞,观察TLR4表达变化,以及AT1受体阻断剂和AT2受体阻断剂的作用。通过测定细胞培养液中TNF-α的含量,观察在缺氧/复氧损伤和AngⅡ刺激所引起的炎症反应效应及药物的作用。实验结果：缺氧/复氧可以引起BV-2细胞损伤性改变,表现为细胞存活率降低,释放LDH增加。与模型组比较,氯沙坦可以对抗缺氧/复氧所致细胞损伤,而PD13319没有作用。RT-PCR. Western Blot研究表明,与对照组比较,缺氧/复氧损伤可以引起TLR4 mRNA和蛋白水平明显增加。与模型组比较,AT1受体阻断剂氯沙坦可以抑制TLR4的表达增加,而PD13319无明显影响。在缺氧/复氧损伤后,TLR4的配体脂多糖(LPS)可以促进细胞生成TNF-α,同样该反应可以被氯沙坦阻断。单独AngⅡ刺激也可引起BV-2细胞存活率降低、LDH释放等损伤反应,同时可以引起细胞产生TNF-α增加,细胞TLR4在mRNA和蛋白水平上表达增加。上述变化可以被氯沙坦抑制,PD123319无显著影响。结论：1.缺氧/复氧以及AngⅡ均可以引起BV-2小胶质细胞株TLR4表达增加。2.氯沙坦可以抑制缺氧/复氧导致的TLR4表达增加,而PD 123319对缺氧/复氧导致的TLR4表达增加无明显影响。说明AngⅡ参与了缺氧/复氧导致的TLR4表达。AngⅡ对BV-2小胶质细胞株TLR4表达的调控是通过AT1受体发挥的。3.氯沙坦对缺氧/复氧引起的BV-2细胞损伤具有保护作用,作用机制之一是通过抑制TLR4信号通路发挥的。4.AngⅡ可以对BV-2小胶质细胞株产生损伤,并引起TLR4表达增加,氯沙坦可以抑制此作用,而PD123319无明显影响。说明AngⅡ通过AT1受体调节TLR4表达作用是独立的。5.AngⅡ刺激可以引起BV-2小胶质细胞株生成TNF-a增加,提示AngⅡ对BV-2小胶质细胞株产生损伤作用机制与炎症反应有关,TLR4可能是这个通路的中间环节。6.LPS刺激或者缺氧/复氧刺激均可以引BV-2小胶质细胞株培养液中TNF-a含量增加,缺氧/复氧则可以进一步增加LPS所致的TNF-a含量增加。这说明TLR4表达增加是伴随着整个信号通路活化并产生炎症效应的。