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迄今为止,松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)已经成为我国最为严重的林业外来有害生物之一,对世界松林造成毁灭性破坏。在入侵到中国的过程中,松材线虫同本地媒介昆虫松墨天牛(Monochamus alternatus)和本地伴生蓝变菌Sporothrix sp.1形成“松材线虫-松墨天牛-蓝变菌”共生体。松墨天牛作为中国松材线虫的主要昆虫媒介,在松材线虫病的传播过程中发挥着重要作用。本课题组已有研究发现,在松墨天牛蛹室周围聚集有大量本地伴生蓝变菌Sporothrix sp.1且Sporothrix sp.1能显著改善松墨天牛的生长。我们采用无参考基因组的转录组测序技术对感染了本地伴生蓝变菌Sporothrixsp.1和虫生真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的松墨天牛进行转录组测序,注释出免疫基因,并且比较两种处理中免疫基因的表达,从而得出松墨天牛与本地伴生蓝变菌Sporothrix sp.1间的相互作用的特点。该研究将会使人们对松墨天牛与其本地伴生蓝变菌在基因表达层面的相互作用有一个初步的认识。 本地伴生蓝变菌Sporothrix sp.1和虫生真菌球孢白僵菌感染松墨天牛初期蛹,感染24 h和48 h后分别提取脂肪体组织构建cDNA文库。通过Illumina高通量测序和Trinity组装软件对短序列进行de novo组装,通过原始数据加工得到55,059条松墨天牛转录本。 主要研究结果和创新点如下: 1.松墨天牛免疫基因特点。 蓝变菌和球孢白僵菌的感染实验和体表接触实验结果都表明:感染本地伴生蓝变菌Sporothrix sp.1不会导致松墨天牛死亡,松墨天牛能够继续发育成成虫。对不同处理差异表达基因进行GO(gene ontology)功能分析,结果显示差异表达基因主要存在于生物过程和分子功能方面;KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics)信号通路分析表明碳水化合物等代谢途径中差异表达基因占很大比重,推测蓝变菌可能使松墨天牛代谢加速,松墨天牛对蓝变菌的感染会产生相应的免疫反应,而且生理代谢基因表达也发生变化。 2.研究松墨天牛对伴生蓝变菌和致病白僵菌免疫反应的特点不同,在伴生蓝变菌感染中各通路相互协调共同应对外界刺激。 转录组测序Sporothrix sp.124 h文库注释出的与天牛免疫相关的差异表达基因主要集中在胞内信号转导阶段。Toll信号通路发现23个免疫基因,在四类主要的信号通路中所占数量最多,其次是IMD信号通路。挑选转录组差异表达明显的免疫基因进行统计发现:四个胞内主要免疫信号通路相关基因都有参与,主要以Toll和IMD信号通路为主。结果表明在蓝变菌的感染过程中Toll和IMD信号通路都有参与。 3.天牛Toll和IMD信号通路被抑制而对蓝变菌Sporothrix sp.1产生免疫逃避。 挑选转录组中差异表达明显的免疫相关基因进行实时荧光定量PCR检测,对检测结果进行热图聚类发现:感染蓝变菌Sporothrix sp.1的天牛的Toll和IMD免疫信号通路关键基因在感染后24 h高水平表达,但免疫持续时间较短,感染后48 h大部分Toll基因表达量受到抑制,产生免疫逃避现象。与此相反,感染同为真菌的球孢白僵菌的Toll信号通路基因反应强度随时间而增强,使松墨天牛的免疫系统崩溃,最终导致寄主死亡。 本次研究通过无参考基因组的转录组测序技术首次提供了大量松墨天牛的序列资源,通过对本地伴生蓝变菌免疫反应特点的研究为未来研究宿主与共生真菌间的相互作用的分子机制提供了非常有价值的参考信息。