论文部分内容阅读
第一部分 载IR780靶向多功能纳米粒的制备和表征目的 制备载IR780靶向多功能纳米粒(cRGD-PLGA-IR780-PFP),对其一般性质包括大小、电位、体外靶向性及生物安全性等进行检测。方法 利用双乳化法合成PLGA-IR780-PFP,并用碳二亚胺法将靶向多肽cRGD连接于PLGA-IR780-PFP的表面,制备出靶向多功能纳米粒(cRGD-PLGA-IR780-PFP)。检测其一般性质包括粒径和电位等;对cRGD的靶向性进行检测;共聚焦显微镜下观察B16细胞对纳米粒的吞噬情况;绘制IR780的标准曲线并对cRGD-PLGA-IR780-PFP中IR780的包封率进行计算;采用CCK-8法检测不同浓度cRGD-PLGA-IR780-PFP、cRGD-PLGA-IR780和PLGA-IR780-PFP(三种纳米粒中IR780的量一致)与B16细胞孵育24 h对细胞的毒性;将BALB/c老鼠随机分为4组:对照组、注射cRGD-PLGA-IR780-PFP后1天组、7天组、15天组,尾静脉注射cRGD-PLGA-IR780-PFP不同时间后对小鼠进行眼球取血,将收集到的样本进行血常规和血生化分析。结果 成功制备的cRGD-PLGA-IR780-PFP大小约(255.83±5.46)nm,电位约(-0.55±0.037)mV;透射电镜(TEM)及扫描电镜(SEM)下其形态规则,大小均一;核磁共振氢谱(H-NMR)可见cRGD-PLGA和PLGA相比有明显的多肽特征峰,共聚焦显微镜可见FITC的绿色荧光和DiI的红色荧光完全重合,流式检测cRGD的连接率高达98.06%;紫外分光光度计检测cRGD-PLGA-IR780-PFP在780 nm波长处可见较强的吸收峰,根据IR780的标准曲线计算得出包封率为(91.93±0.68)%;CCK-8法检测三种纳米粒(cRGD-PLGA-IR780-PFP、cRGD-PLGA-IR780和PLGA-IR780-PFP)对B16细胞无毒性作用;小鼠的血常规和血生化指标显示cRGD-PLGA-IR780-PFP无生物毒性作用。结论 成功制备出包载IR780和液态氟碳的靶向多功能纳米粒(cRGD-PLGA-IR780-PFP),其大小均一、分散性好,与cRGD的连接率高,生物安全性好,为进一步的多模态成像及光热治疗奠定了基础。第二部分 载IR780靶向多功能纳米粒多模态成像的研究目的 研究载IR780靶向多功能纳米粒在体外和体内增强超声/光声/近红外荧光成像的能力。方法 体外超声成像实验分为cRGD-PLGA-IR780-PFP不同浓度组,cRGD-PLGA-PFP组和生理盐水组,各组均用808 nm激光辐照,观察不同时间点的超声显像,并用光学显微镜观察靶向纳米粒相变的能力;体外光声成像和近红外荧光成像分别利用光声成像仪及小动物活体成像仪观察不同浓度的cRGD-PLGA-IR780-PFP体外光声及荧光成像的能力并记录相应的光声值和荧光值;体内多模态成像实验分组为I:cRGDPLGA-IR780-PFP(靶向组)、II:PLGA-IR780-PFP(非靶向组)和III:生理盐水(对照组),其中光声成像是通过尾静脉给黑色素瘤B16荷瘤小鼠分别注射I-III,近红外荧光成像实验则通过尾静脉注射I和II,然后对不同时间点(0、0.5、6、24 h)的各组小鼠进行光声或近红外荧光成像并记录相应的光声值和荧光值,并在24 h后对各组小鼠的离体器官和肿瘤进行近红外荧光成像并记录荧光值;体内超声成像实验是通过尾静脉给黑色素瘤B16荷瘤小鼠注射I-III,6 h后通过808 nm激光辐照肿瘤,并对小鼠肿瘤进行超声成像并记录肿瘤区域的灰阶值。结果 cRGD-PLGA-IR780-PFP在体外增强了超声/光声/近红外荧光成像。浓度越高时对应的超声灰阶值越大,808 nm激光辐照5 min时达峰值,10 min后,随着相变结束,各组灰阶值降低,其相变过程可被光学显微镜监测到。体外光声成像显示纳米粒的光声值与浓度成正比。体外荧光成像显示随着纳米粒浓度(1-20 mg/ml)增加,荧光值逐渐升高,但超过20 mg/ml时会使荧光值降低。体内光声成像和近红外荧光成像显示小鼠注射纳米粒6 h后靶向组肿瘤部位的光声值及荧光值达最高,24 h后均降低,非靶向组和生理盐水组24 h内光声值和荧光值均升高不明显,24 h后对离体器官和肿瘤进行近红外荧光成像显示靶向组肿瘤部位荧光值高于非靶向组。体内超声成像显示在荷瘤小鼠注射纳米粒6 h后,靶向组超声成像显著增强,非靶向组和生理盐水组未明显增强。结论 制备的cRGD-PLGA-IR780-PFP在体外和体内均可增强超声/光声/近红外荧光成像,纳米粒在激光的辐照下发生光致相变可增强体内外超声成像,IR780在近红外区的强烈吸收峰可增强靶向多功能纳米粒在体内外光声及近红外荧光成像,且靶向纳米粒于注射6 h后在肿瘤区域富集最多。第三部分 载IR780靶向多功能纳米粒增强光热治疗的研究目的 研究靶向载IR780多功能纳米粒(cRGD-PLGA-IR780-PFP)在体外及体内增强光热治疗的能力。方法 将cRGD-PLGA-IR780-PFP稀释为不同浓度组,通过近红外热成像仪检测其在808 nm激光(2 W/cm2)辐照下的温度变化,并检测纳米粒(5 mg/ml)在不同激光强度下的温度变化;体外光热治疗实验分为:I、cRGD-PLGA-IR780-PFP,II、PLGA-IR780-PFP和III、cRGD-PLGAIR780,通过CCK-8试验研究不同纳米粒在有无808 nm激光辐照时对B16细胞的生物毒性作用,并通过共聚焦显微镜研究I-III在有无808nm激光辐照时的细胞活性,以生理盐水作为对照组;体内对黑色素瘤B16荷瘤小鼠进行光热治疗,实验分为1:cRGD-PLGA-IR780-PFP+NIR、2:PLGA-IR780-PFP+NIR;3:cRGD-PLGA-IR780+NIR,4:生理盐水+NIR;5:cRGD-PLGA-IR780-PFP,6:生理盐水6组,每组小鼠尾静脉注射相同浓度纳米粒,1-4组肿瘤给予激光辐照,整个辐照过程被近红外热成像仪监控,在治疗完成后观察14天,并记录肿瘤大小和小鼠体重的变化,同时对治疗第2天的肿瘤进行H&E染色、PCNA及TUNEL检测。结果 cRGD-PLGA-IR780-PFP在相同强度的激光辐照下的最大温度呈浓度依赖性;在浓度相同时,激光强度越高,温度上升越高。体外细胞毒性试验显示不同纳米粒I-III在0-1 mg/ml浓度范围内对B16细胞是安全的。体外PTT实验提示靶向纳米粒激光辐照组的治疗效果最强,说明PFP增强了纳米粒的光热作用。体内的光热实验显示,靶向纳米粒激光辐照组肿瘤温度上升最高,在观察期14天内其肿瘤生长明显受到抑制,通过肿瘤的H&E染色,PCNA及TUNEL免疫组化检测可见靶向纳米粒激光辐照组的治疗作用最明显。结论 cRGD-PLGA-IR780-PFP在激光辐照下的光热治疗效果非常好,呈浓度依赖性和激光强度依赖性,且纳米粒发生相变时可明显增强其光热治疗效果。体内光热治疗可显著地抑制黑色素瘤的生长。