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L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase, LAAO)是蛇毒中的重要毒性成分,具有复杂多样的生物学功能,包括抗肿瘤活性。本文从中华眼镜蛇毒中分离纯化LAAO,鉴定其纯度和理化性质,并对其体外抗肿瘤作用、诱导细胞凋亡作用及机制进行研究,为其可能的应用提供实验依据。1.中华眼镜蛇L-氨基酸氧化酶的纯化与鉴定通过凝胶过滤、疏水层析和离子交换层析法从眼镜蛇粗毒中分离LAAO并鉴定其理化性质,结果:①通过凝胶过滤、疏水层析和离子交换层析法从眼镜蛇粗毒中分离得到LAAO,每500 mg蛇毒中可纯化得到6 mg LAAO,蛋白回收率1.2 %,酶活力回收率43.3 %,通过分子筛和RP-HPLC和SDS-PAGE证实其是均一蛋白;②NA-LAAO由两个相同的亚基组成,每个亚基的分子量是55 kDa,全酶分子量120kDa;③通过肽质量指纹图谱鉴定,发现该蛋白序列与眼镜蛇L-氨基酸氧化酶cDNA高度相符。2.眼镜蛇L-氨基酸氧化酶体外抗肿瘤细胞增殖作用及机制采用CCK-8法测定NA-LAAO的细胞毒性及对细胞生长增殖能力的影响;采用流式细胞术、实时定量PCR和Western-blot等方法分析NA-LAAO对ECV304细胞周期相关基因mRNA和蛋白质表达的影响。结果:①CCK-8实验显示,NA-LAAO对体外培养的肿瘤细胞的生长有强烈抑制作用,且呈剂量-效应和时间-效应关系。NA-LAAO处理6 h、12 h、24 h对K562的半数抑制浓度(IC50)分别为0.80、0.38和0.25μg/ml;对ECV304为1.54、1.09和0.48μg/ml;对MGC803为2.48、1.74和0.83μg/ml;对U251为3.18、1.79和0.88μg/ml;对A549为15.4、6.78和2.61μg/ml;不同细胞株对NA-LAAO的敏感性存在较大差异;②细胞增殖实验显示,0.156μg/ml的NA-LAAO作用4天以后,可明显抑制ECV304细胞增殖;0.313μg/ml的NA-LAAO第2天起就有明显效果;0.625μg/ml的NA-LAAO处理后,细胞多数死亡;③流式细胞术分析提示NA-LAAO可影响ECV304的细胞周期,使细胞阻滞在G1期,并呈量效关系;④实时定量PCR结果显示,NA-LAAO可下调Cyclin A2、B1、D1、E1, CDK2、CDK6、Survivin、Skp2,上调p21、p16、p27的表达,Western-blot结果显示NA-LAAO可下调CyclinA、CDK2、CDK6,上调p21,与定量PCR一致,可能与其阻滞细胞周期有关。3.眼镜蛇L-氨基酸氧化酶诱导肿瘤细胞凋亡及机制本研究通过AO/EB染色、DNA含量测定、Annexin V/PI染色、线粒体膜电位测定、Caspases和PARP切割实验等方法,探讨NA-LAAO对肿瘤细胞凋亡的影响;通过实时定量PCR和Western-blot分析NA-LAAO对凋亡调控蛋白Bcl-2家族分子的影响,探讨NA-LAAO诱导细胞凋亡的机制。结果:①AO/EB形态学观察发现,低剂量NA-LAAO可使细胞出现凋亡样特征;流式细胞术检测发现,NA-LAAO可使细胞的DNA含量降低,出现亚二倍体DNA凋亡峰;Annexin V/PI双染检测发现,NA-LAAO可使细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻;流式细胞术检测发现,NA-LAAO处理8 h可使ECV304细胞中的JC-1发生从红色荧光到绿色荧光的转变,这些结果说明NA-LAAO可诱导肿瘤细胞凋亡;②NA-LAAO处理可使Caspase-9、Caspase-3活化,并降解Caspase-3底物PARP-1,提示NA-LAAO可激活内源性凋亡途径;③高浓度NA-LAAO导致的细胞死亡不受Caspases抑制剂z-VAD-fmk影响,提示NA-LAAO可诱导不依赖于Caspases的细胞死亡;④实时定量PCR和Western-blot结果显示,NA-LAAO可上调促凋亡蛋白Bax、Hrk、Noxa和Puma,提示Bcl-2家族蛋白在NA-LAAO诱导的肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用。综上所述,本研究从中华眼镜蛇毒中分离得到LAAO,并对其体外抗肿瘤作用、诱导细胞凋亡作用及机制进行了研究,为进一步深入探讨其作用机制和可能的应用奠定了基础。