论文部分内容阅读
有机磷酸酯类农药多为广谱、高效、剧毒的杀虫剂。我国农村的广泛、长期的使用导致的高残留对生态环境和人类的食品安全已构成了巨大的威胁。 土壤微生物对农药的分解能消除农药的残留，减小农药对生态系统的影响。本实验设计研究了此类农药的微生物降解特性，意在克隆出降解农药的基因，并应用于田间农业作物，将有效地解决农业生产过程中有机磷酸酯类农药残留问题，为农业无公害生产提供新途径。 本课题研究主要包括两大方面：(1)有机磷酸酯类农药降解菌的分离及其降解特性的初步研究。驯化富集培养分离到三株能以乐果(dimethoate)、敌敌畏(dichlorvos)有机磷酸酯类农药为唯一碳源的菌株X1、X2、X3。其中X2为革兰氏阳性菌，其余两株均为革兰氏阴性菌，。由于目前研究的能够降解农药的微生物大多数为革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌较为少见，故选用X2作为实验材料。根据生理生化鉴定和16S rDNA测序分析将X2鉴定为黄色节杆菌(Arthrobacterflavescens)。高效液相色谱(HPLC)测定结果表明，此菌株在72小时内对800 mg/L的乐果，500 mg／L敌敌畏的降解率分别为88.11％和96.32％。该菌最适生长温度为28℃，最适pH为7.0，对乐果和敌敌畏的最高耐受浓度分别为1600 mg/L和800mg／L。X2对有机磷酸酯类农药有明显的降解作用，但对于非磷酸酯类农药草甘膦无降解作用。对菌株进行质粒抽提和大质粒快检，结果表明该菌无质粒存在。 (2)克隆降解有机磷酸酯类农药的基因。用鸟枪法克隆降解磷酸酯类农药的基因。将X2总DNA用限制性核酸内切酶BamHI完全酶切后回收2-5Kb的片段，连接到载体pBluescript KS上，转化大肠杆菌Ecoli DH5α，用含乐果800mg/L，Amp100μg/ml的平板筛选阳性克隆。获得三株阳性克隆EpKS-B1、EpKS-B2和EpKS-B3，将得到的阳性克隆抽质粒进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现重组质粒大小均一样，然后进一步进行酶切验证。连接在载体上的目的基因片段大小约为4Kb，含有此片段的重组质粒pKS-B2使得E.coli DH5α能在30小时内共代谢降解乐果(400 mg/L)，敌敌畏(300mg／L)36.06％和28.77％。