目前纳米材料在工业、制造业、医学等领域用途广泛,人体可以通过吸入和接触等途径大量吸收和积累,所以近年来关于各种纳米材料诱发的毒性引起了广泛的关注和研究。我们从分子和表观两个层面探究中长期中浓度的纳米材料处理对细胞造成的毒性、移除材料后细胞活力的可恢复性,以及组蛋白表观遗传修饰的变化。我们的研究主要关注15天处理时间内细胞的一系列生理生化反应及表观遗传调控的变化。碳纳米管(多壁碳纳米管MWCNT和单壁碳纳米管SWCNT)和金属氧化物纳米颗粒(二氧化钛TiO2 NPs)是目前应用相当广泛的几种纳米材料,在生态环境中的浓度和释放量与日俱增,安全性亟待评估。我们采用MWCNT,TiO2 NPs和SWCNT三种纳米材料以100μg/ml的浓度处理A549细胞,处理时间设计为5天、10天、15天以及处理5天之后移除培养基恢复5天、处理10天之后移除培养基恢复5天等五个不同时间的处理组。细胞活力检测结果显示处理组细胞存活率普遍降低,但是程度不一致,说明纳米材料抑制细胞生长的能力不同。纳米材料摄入性实验结果显示细胞对不同种类纳米材料的吸收有着很大的差异,而且在移除纳米材料后,细胞内纳米材料的积累量下降的程度也不同,其中细胞对TiO2 NPs的吸收和排出程度都很高。随后我们检测了不同时间处理组和移除纳米材料的恢复组细胞内活性氧水平、溶酶体膜结构受损程度和DNA双链的损伤状况。结果表明三种纳米材料的处理均会导致细胞内活性氧水平的升高、溶酶体膜通透性增加和DNA双链断裂。移除纳米材料后,三种纳米材料处理过的细胞活力恢复情况各不相同。TiO2NPs处理过的细胞几乎能还原到正常细胞的生理生化指标,细胞内活性氧水平下降,溶酶体膜结构损害程度减弱,DNA损伤幅度下降;但是MWCNT处理过的细胞即便在正常培养基生长中还是体现出受到较强的毒性和损伤,在相同时间内不能还原到正常水平。证明在相同浓度和处理时间下,MWCNT诱导的基因和细胞毒性最强,细胞的应激反应最明显,其次是SWCNT,最弱的是Ti02NPs。在移除纳米材料后,细胞活力都有不同程度的恢复,恢复程度最高的是Ti02NPs处理下的细胞,其次是MWCNT和SWCNT。当细胞核受到外界压力时,组蛋白表观遗传譬如赖氨酸残基修饰的改变会引起核染色质结构的重塑。为了探究伴随纳米材料诱导基因毒性过程中的表观遗传修饰的变化,我们检测了 MWCNT,TiO2 NPs和SWCNT三种纳米材料处理A549细胞诱导的细胞组蛋白H3K9me2,H3K9ac,H4K5ac和H3K4me2表达量的变化。结果显示与对照组相比,四种标志性表观遗传修饰均处在动态变化中。证明为应对外界压力,细胞核常染色质和异染色质之间不断地发生转变。之后我们检测了不同时间处理组和移除纳米材料的恢复组细胞的细胞周期进程。结果表明三种纳米材料作用细胞最终分别导致了G1期、G2/M期等不同时期的细胞周期阻滞。为了进一步探究表观遗传修饰是否参与调控细胞分裂生长过程中的重要基因的表达,我们检测了三种纳米材料处理下细胞PCNA基因的表达量和该基因启动子及转录部分区域组蛋白H3K9me2的修饰状况。增殖细胞核抗原(PCNA)是调控真核生物DNA复制、损伤修复、细胞周期等多个生物学事件的关键基因,还可以作为细胞增殖的指标。组蛋白H3K9me2被认为是异染色质的标志,可以影响基因转录过程并导致基因沉默。反转录荧光定量PCR分析结果表明,三种纳米材料处理下细胞PCNA基因的表达量呈现不同程度的下降,ChIP结果显示不同纳米材料侵染后细胞PCNA基因启动子和转录部分区域组蛋白H3K9me2甲基化程度差异明显,暗示H3K9me2组蛋白修饰可能参与了细胞PCNA基因mRNA的转录。根据以上结果我们可以推断:MWCNT,Ti02 NPs和SWCNT三种纳米材料进入细胞后扰乱线粒体、溶酶体等细胞器的正常功能,并向细胞核施加压力,造成细胞内活性氧水平升高、溶酶体膜结构损伤、DNA双链断裂等一系列毒性效应。与此同时,表观遗传修饰伴随着纳米材料所诱导细胞核压力应答的过程,参与了组蛋白整体修饰和细胞增殖基因PCNA等关键基因的转录调控,动态调节了染色质结构以及重要基因表达。纳米材料作用于细胞最终导致的结果是细胞周期阻滞,细胞分裂生长速度减慢甚至死亡。不同纳米材料对细胞的毒性影响取决于材料类型、处理浓度以及处理时间,在移除纳米材料后,细胞恢复能力不尽相同,Ti02 NPs处理过的细胞恢复能力最强,MWCNT处理过的细胞恢复能力最弱。