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猪对氮营养素的利用效率受诸多因素的影响,日粮蛋白水平是影响猪的生长发育和养分利用效率的关键因素。肝脏是哺乳动物重要的代谢器官,日粮蛋白水平在肝脏氨基酸代谢、分泌性蛋白质合成、尿素循环、糖脂代谢、排毒等生化过程中发挥着重要作用,其中尿素循环是体内氮排放的主要形式,但其分子调控机制还不清楚。因此本研究通过利用高通量测序手段比较分析了低蛋白日粮与正常蛋白日粮断奶仔猪肝脏相关蛋白质和mi RNA表达规律,并对差异表达的蛋白和mi RNA进行相互作用的网络分析,以寻找与调控尿循环素代谢相关的关键mi RNA,为低蛋白日粮调控肝脏尿素循环的分子机制提供理论依据。试验一、试验选用18头28日龄断奶的杜×长×大三元杂交仔猪（初始体重:9.57±0.61kg）,随机分为3个处理组,3组日粮的粗蛋白质（Crudeprotein,CP）水平分别为20%CP、17%CP和14%CP。饲养30d后采集血样和肝脏用于蛋白组学分析和后续相关指标检测。i TRAQ结果显示3个试验组肝脏中共获得6222个蛋白,17%CP与20%CP相比共得到的差异蛋白172个;14%CP与20%CP相比共得到差异蛋白235个。KEGG通路分析显示17%CP与20%CP相比得到的差异蛋白共富集到13条通路,14%CP与20%CP组富集的通路有15条,均主要是集中在与氨基酸代谢、糖脂代谢、维生素代谢、氧化应激、免疫、ECM等的代谢通路。i TRAQ数据结合Western Blot验证和其他相关指标的检测结果发现,与20%CP组相比较,14%CP显著抑制了肝脏蛋白质的生物合成,而17%CP促进了蛋白质的生物合成;低蛋白日粮（14%CP组和17%CP组）均显著抑制肝脏尿素合成,糖异生和脂肪氧化,促进了肝糖原和脂肪合成。试验二、为了分析低蛋白日粮与正常日粮组间差异mi RNA表达规律,并筛选到与尿素循环相关mi RNA,本试验采用Solexa深度测序技术分析不同蛋白日粮组猪肝脏mi RNA表达谱。结果共检测到606条成熟体mi RNAs,其中差异的mi RNA有52个,其中上调的为30个,下调的为22个,其中3个上调的mi RNA（ssc-mi R-19b,ssc-mi R-19a hsa-mi R-192-3p＿R-1）表达趋势在14%CP和17%CP趋势相反。通过生物信息学分析发现共有15个mi RNA靶向尿素循环关键酶及其调控因子,提示这些mi RNA可能参与了调控尿素循环的过程。试验三、本试验选择了8个mi RNA合成其模拟物mimics转染至猪原代肝细胞,观察细胞外尿素合成变化,发现靶向SIRT5的3个mi RNAs（ssc-mi R-19b、ssc-mi R-145-5p、ssc-mi R-204）mimics显著影响了细胞外尿素含量和SIRT5/CPS1的蛋白表达;这3个mi RNA的inhibitor转染肝细胞后发现ssc-mi R-19b和ssc-mi R-204inhibitor显著促进了尿素合成,但ssc-mi R-145-5pinhibitor的结果与mimics结果相矛盾。接着我们采用双荧光素酶报告系统验证这3个mi RNAs对SIRT5 3’-UTR的靶向作用,结果证实了ssc-mi R-19b对SIRT5的靶向作用。同时,我们利用不同浓度氨基酸处理猪原代肝细胞,结果发现高浓度的氨基酸显著增加尿素的合成及SIRT5和CPS1的蛋白表达量（P<0.05）,随后又用mi R-19b mimics干预后,尿素含量和SIRT5和CPS1的蛋白表达量得到了抑制,这个结果进一步证实了低蛋白日粮下ssc-mi R-19b的通过靶向SIRT5的抑制其蛋白表达从而降低CPS1酶活减少了尿素合成。试验四、为了验证mi R-204是否通过靶向糖皮质激素受体（GR）调控尿素循环,我们首先通过荧光素酶双报告基因系统验证了mi R-204对预测到的靶基因GR3’-UTR的靶向作用,再以猪原代肝细胞为研究对象,使用人工合成的ssc-mi R-204mimic或inhibitor处理原代肝细胞（以NC或i NC为阴性对照）,检测细胞内GR蛋白表达及细胞上清尿素含量等指标来验证mi R-204是否通过靶向GR调控尿素循环。双荧光素酶报告系统结果显示ssc-mi R-204可显著抑制荧光素酶活性（P<0.05）,而缺失和突变了mi R-204的作用位点的荧光素酶活性不再受ssc-mi R-204影响,证实了ssc-mi R-204对GR的靶向作用。在转染猪原代肝细胞后发现ssc-mi R-204mimics显著降低CPS1和GR蛋白表达（P<0.05）,而inhibitor却恢复了mi R-204 mimics的作用。此外通过用不同浓度地塞米松处理肝细胞后用mi R-204mimics进行干预处理的结果进一步证实了ssc-mi R-204通过靶向GR抑制尿素合成。同时,本试验利用不同浓度氨基酸处理肝细胞后发现高浓度的氨基酸显著增加尿素的合成及GR和CPS1的蛋白表达量（P<0.05）,随后又用mi R-204 mimics干预后,尿素含量及GR和CPS1的蛋白表达量得到了抑制,这些结果进一步证实了低蛋白日粮情况下ssc-mi R-204通过靶向GR抑制尿素合成。综上所述,本研究通过全面的比较分析了不同蛋白日粮对猪肝脏蛋白质和mi RNA表达的差异,并验证了差异表达的ssc-mi R-19b和ssc-mi R-204分别通过靶向SIRT5和GR抑制它们的蛋白表达下调CPS1基因表达,从而减少了尿素的合成。