自1997年在亚洲发现第一个H5N1人的病例,H5N1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)已经迅速蔓延至亚洲、欧洲以及非洲范围内的超过60多个国家和地区。禽流感病毒能够引起急性呼吸系统疾病,不但能感染禽类,给养禽业带来巨大经济损失;而且能跨种传播感染并致死哺乳动物,包括人类,给公共卫生安全带来极大威胁。流感病毒的基因组包含8个RNA片段,能够编码产生超过17种病毒蛋白。PA蛋白是流感病毒聚合酶复合体的第三个亚基,对于流感病毒的生命周期和致病性具有关键作用。首先,PA蛋白的N端具有核酸内切酶活性,参与流感病毒的转录和复制;其次,PA蛋白的某些关键氨基酸是流感病毒的重要毒力因子,能够影响病毒致病性及宿主适应性;最后,PA基因能编码三种新蛋白,包括PA-N155、PA-N182及PA-X,它们对流感病毒的感染有重要作用。因为基因编码能力有限,流感病毒在宿主细胞中的复制严重依赖宿主细胞的复制系统。流感病毒蛋白和宿主蛋白存在广泛的相互作用,这些相互作用对于流感病毒的感染、复制、传播以及宿主抵抗流感病毒的感染都极为重要。考虑到PA蛋白以及病毒与宿主互作在流感病毒生命周期中的重要作用,探究与PA蛋白相互作用的宿主因子并阐明其相关机制对于解析流感病毒的感染机制非常重要。本文选取了一株对小鼠表现为高致病性的H5N1禽流感病毒(CK10)来探索其PA蛋白与人类细胞的互作宿主蛋白。我们筛选到了 278种可能与PA蛋白存在相互作用的宿主细胞蛋白;确实了 Nucleolin(NCL)和 eukaryotic Translation Elongation Factor 1 Alpha 1(eEF1Al)与PA蛋白存在相互作用,而通过与其他PA蛋白互作宿主蛋白的研究比较,我们发现NCL与eEF1A1也在其它亚型禽流感病毒互作宿主蛋白的研究中被筛选到。为了进一步筛选与PA互作的关键宿主蛋白,随后我们又选取了一株对小鼠表现为低致病性的H5N1禽流感病毒GSl0(CK10与GS10对小鼠致病性差异显著,且其致病性的差异主要由PA基因决定),来探究对哺乳动物致病性差异显著的H5N1禽流感病毒PA蛋白的差异互作宿主蛋白。结果发现,与GS10 PA蛋白相比,有160种人类蛋白能够与CK10的PA蛋白特异性的结合,其中包括eEF1A1蛋白。NCL和eEF1A1均具有多种生物学功能。NCL具有内在的自我切割、DNA解旋酶、RNA解旋酶和DNA依赖性ATP酶活性,能够参与核糖体生物合成,细胞分裂与成核、细胞增殖和生长、核糖体成分的核质转运、抑制转录过程、复制和信号转导等生物学进程。eEF1A1不仅是翻译因子,而且能够调节细胞骨架、具有伴侣蛋白活性,影响细胞增殖和细胞死亡。考虑到NCL和eEF1A1的重要生物学功能,我们探索了 NCL和eEF1A1在流感病毒感染过程中的潜在作用,发现NCL和eEF1A1在流感病毒感染体外细胞过程中均发挥着抗病毒的作用。1.筛选并鉴定与CK10病毒PA蛋白互作的宿主蛋白许多研究证实了PA蛋白在流感病毒的复制和致病性中具有重要作用。因此,鉴定与PA蛋白相互作用的宿主因子有助于我们解析流感病毒致病机理。在本章中,通过将CK10感染A549细胞,使用免疫沉淀(immunoprecipitate,IP)结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术,我们筛选到278种可能与CK10病毒PA相互作用的人类细胞蛋白;Gene Onto1ogy(GO)注释显示,所筛选的宿主蛋白与病毒翻译和复制高度相关;KEGG通路分析表明互作蛋白主要参与翻译、传染病和信号转导有关的细胞通路;另外,疾病和功能分析表明这些细胞蛋白与机体损伤和异常以及细胞死亡和存活高度相关。因此,这些生物信息学分析结果表明所筛选的互作宿主蛋白与流感病毒感染十分相关。此外,通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitate,Co-IP)和细胞共定位技术鉴定出两种细胞蛋白质NCL和eEF1A1与PA存在相互作用。因此,本研究通过H5N1PA互作宿主蛋白组学分析,提供了新的细胞靶蛋白来阐明PA在IAV感染人类细胞生命周期中的潜在分子机制。然而,我们仍需要进一步的研究来探索NCL和eEF1A1在流感病毒生命周期中的作用。2.筛选小鼠致病性差异显著的H5N1禽流感病毒PA蛋白差异互作宿主蛋白为了进一步筛选引起H5N1禽流感病毒致病性差异的宿主因子,我们选取了一对主要由PA基因造成在小鼠上致病性差异的H5N1禽流感病毒(CK10与GS10),通过病毒感染A549细胞,利用PA抗体进行免疫沉淀实验以筛选与PA互作的宿主蛋白,并进行LC-MS/MS鉴定。我们发现与低致病性的GS10相比,共有160种宿主蛋白能够特异性与高致病性CK10病毒PA蛋白结合,其中包括第一章筛选到的eEF1A1蛋白。接下来,我们对这160种蛋白进行了生物信息学分析,通过GO注释分析发现这些蛋白主要参与翻译、基因表达、病毒转录和病毒感染等生物学进程,通过KEGG通路分析发现这些蛋白主要参与的细胞通路包括翻译、传染病与信号转导等。因此,本研究筛选到的致病性不同的禽流感病毒PA蛋白的差异互作宿主蛋白,不仅为我们进一步解析致病性差异的流感病毒复杂的致病机理提供重要启示,而且可为抗流感药物开发提供新的方向。3.PA互作宿主蛋白eEFIA1对流感病毒感染的影响及机制初步探索流感病毒依赖宿主的复制系统进行增殖,eEF1A1具有多种生物功能,如翻译、细胞骨架调节、调节细胞分裂及细胞死亡等,并且我们发现eEF1A1与流感病毒PA蛋白具有相互作用。因此我们探究了 eEF1A1对于CK10病毒感染体外细胞后的影响。我们发现干扰eEF1A1表达显著提高CK10在A549细胞中的RNP活性、病毒mRNA、cRNA、vRNA的合成、复制效率、细胞因子表达(包括IL-6、TNF-α、TNF-β、CCL-4、CCL-8、IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、显著增强聚合酶成分的核聚集能力;相反过表达eEF1A1后CK10的复制效率显著降低。有趣的是,eEF1A1对其它亚型禽流感病毒的复制效率也发挥着抑制作用,包括H5N6和H7N9亚型禽流感病毒,表明eEF1A1抑制流感病毒的复制具有广谱性。除此之外,我们还发现eEF1A1对于病毒引起的细胞凋亡没有影响,但是能够促进病毒引起的细胞坏死。RNA-seq分析结果显示干扰eEF1A1表达,能够调节CK10引起的细胞因子通路、A型流感病毒通路、转录及负调控细胞死亡基因表达上调,这与eEF1A1在CK10病毒感染期间抑制病毒复制、降低细胞因子表达和促进细胞坏死结果吻合。因此,我们认为eEF1A1在流感病毒感染过程中主要发挥抗病毒作用,而且在病毒引起的细胞坏死中发挥着重要作用。4.PA互作宿主蛋白NCL对流感病毒感染的影响及机制初步探索一方面,IAV是在宿主细胞核中复制的病毒,它需要劫持宿主细胞核内的复制系统以达到最佳感染。因此RNP复合物的入核对于病毒劫持宿主细胞的复制系统和随后的病毒复制是必要的。另一方面,NCL主要分布在核仁中,少量分布在核质、细胞质和细胞膜。因此,考虑到NCL在多种生物过程中的重要功能,包括核糖体生物合成、DNA修复和复制、胞质分裂、病毒感染和RNA转录,NCL极有可能影响病毒RNP活动和病毒繁殖。基于这个假设,我们推测NCL-PA的相互作用可能在IAV感染和增殖中具有重要作用。因此,本研究基于NCL在病毒感染过程中能够与PA相互作用,我们进一步探索了NCL在CK10病毒感染人源细胞期间的潜在作用。我们通过转染siRNA的方法抑制细胞NCL表达后,发现CK10病毒的病毒聚合酶活性、mRNA,cRNA和vRNA合成、复制效率和病毒引起的细胞凋亡和坏死水平均显著性地提高。此外,抑制NCL表达显著增强了细胞因子应答反应,包括 IL-6、TNF-α、TNF-β、CCL-4、CCL-8、IFN-α、IFN-β 和 IFN-γ。相反,过表达NCL能够显著抑制CK10病毒的复制。因此,总的来说,我们发现NCL在H5N1感染期间发挥着抗病毒效应,继续探索其抗病毒机理将有助于我们对流感病毒致病机理的理解并且加速抗病毒新药的研发。