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肿瘤微环境主要是由肿瘤细胞和间质细胞构成的,两者相互影响共同促进了肿瘤的发生发展。免疫细胞特别是单核巨噬细胞是肿瘤微环境中构成间质细胞的重要群体,可以通过影响免疫监视、肿瘤血管新生和肿瘤细胞侵袭转移等方式参与肿瘤进展的整个病理进程。因此,分析肿瘤微环境中癌细胞和肿瘤浸润单核巨噬细胞的特性和功能对于了解肿瘤生物学特征和进展状态具有重要的意义。本论文以负性共刺激分子PD-L1为切入点,以肺癌的不同部位的癌细胞和单核巨噬细胞为研究对象,对比研究肺癌微环境中PD-L1表达特点、临床意义和生物学特征。第一部分:PD-L1在非小细胞肺癌细胞的表达特征以及临床意义目的:检测非小细胞肺癌组织中负性共刺激分子PD-L1的表达,探讨PD-L1在非小细胞肺癌中表达的临床意义和生物学功能。方法:收集苏州大学附属第一医院初诊肺癌患者手术切除的非小细胞肺癌标本102例,通过免疫组织化学技术分析PD-L1蛋白在肿瘤细胞的表达,同时结合患者的临床资料,分析PD-L1蛋白在非小细胞肺癌肿瘤细胞中的表达与患者临床资料参数之间的相关性。流式细胞术检测癌组织中浸润CD3+T细胞及CD8+T细胞数量,并分析其与肿瘤细胞PD-L1表达水平的关系;运用PD-L1阻断性抗体分析肺癌A549细胞表达的PD-L1在T细胞体外增殖中的生物学作用。结果:1.在102例非小细胞肺癌中62例(60.78%)肿瘤细胞PD-L1蛋白呈高表达,但在癌旁肺上皮细胞和肿瘤远端的正常肺上皮细胞不表达PD-L1;2.PD-L1在非小细胞肺癌肿瘤细胞中的表达与肿瘤淋巴结转移和临床分期密切相关(P<0.01),而与性别、年龄、肿瘤大小、病理类型及分化程度之间未发现相关性(P>0.05);结合随访数据分析显示,肿瘤细胞PD-L1蛋白的表达水平与患者生存期有关,PD-L1高表达的患者生存时间较短,预后较差(P<0.05);3.与PD-L1低表达的肿瘤组织相比,PD-L1高表达的肿瘤组织中浸润CD8+T细胞数量减少(P<0.05),CD3+T细胞数量无明显变化(P>0.05);4.PD-L1阻断型抗体提高了与A549细胞共培养的T细胞的体外增殖(P<0.05)。结论:1.PD-L1蛋白在非小细胞肺癌肿瘤细胞高表达,非肿瘤组织的肺上皮细胞不表达PD-L1;2.PD-L1表达水平与肿瘤淋巴结转移、临床分期及预后密切相关;3.PD-L1表达水平与肿瘤浸润CD8+T细胞数量相关,阻断肿瘤细胞PD-1/PD-L1信号可以显著提高与肿瘤细胞共培养的T细胞的体外增殖。由此表明,PD-L1在肿瘤细胞上表达是非小细胞肺癌肿瘤微环境中抑制T细胞免疫应答的重要机制。第二部分:PD-L1在非小细胞肺癌患者不同组织CD14+单核/巨噬细胞表达的特征及其临床意义目的:肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)是一群在实体瘤组织中浸润的以CD45+CD14+为表型特征的单核样髓系来源细胞。作为重要的抗原递呈细胞,TAM在肿瘤免疫逃逸中发挥了重要作用。本文旨在分析PD-L1在非小细胞肺癌患者不同部位组织浸润CD14+单核/巨噬细胞上的表达特征,并探讨其临床意义。方法:1.收集60例非小细胞肺癌癌灶组织以及对应的癌远端肺组织标本和部分对应的外周血标本,检测PD-L1在组织以及外周血中的单核/巨噬细胞上的表达特征;2.结合病例资料分析PD-L1在单核/巨噬细胞上表达的临床意义;3.LLC细胞构建小鼠肺癌模型,分析不同的时间点单核巨噬细胞上PD-L1表达的规律;4.用阻断性抗PD-L1抗体干扰PD-1/PD-L1信号,探讨PD-L1在单核巨噬细胞上发挥的生物学功能。结果:1.与癌远端肺组织浸润巨噬细胞相比,PD-L1在癌灶组织浸润CD14+单核/巨噬细胞的表达显著升高(P<0.01);2.肿瘤转移淋巴结浸润CD14+单核/巨噬细胞上PD-L1表达水平显著高于对应的非肿瘤转移淋巴结浸润巨噬细胞(P<0.01);3.结合患者病理资料分析发现,PD-L1在癌灶组织浸润CD14+单核/巨噬细胞上的表达水平与肿瘤分期以及淋巴结转移密切相关(P<0.05);4.动态监测LLC荷瘤小鼠不同的时间点单核/巨噬细胞上PD-L1表达发现,随着荷瘤时间的延长和肿瘤负荷增加,PD-L1在单核/巨噬细胞上的表达也随之增加;5.功能学实验证实,PD-L1阻断型抗体可以逆转单核/巨噬细胞介导的T细胞增殖抑制(P<0.01)。结论:1.PD-L1在非小细胞肺癌浸润单核/巨噬细胞上表达增高,其表达水平与肿瘤淋巴结转移以及临床分期密切相关;2.随着肿瘤负荷的增加,单核/巨噬细胞上表达的PD-L1也逐步增加;3.阻断PD-1/PD-L1信号途径可以逆转单核/巨噬细胞对T细胞增殖的抑制作用。由此表明,PD-L1在单核/巨噬细胞上表达是非小细胞肺癌肿瘤微环境中抑制T细胞免疫应答的重要机制。综上所述,本研究以PD-L1为切入点,从肿瘤微环境中的癌细胞和肿瘤相关巨噬细胞入手,通过免疫组织化学和流式细胞检测的方法,检测了肺癌患者不同组织及不同部位PD-L1的表达情况,并结合临床资料进行分析,得出以下有价值的结论:(1)肺癌细胞高表达PD-L1,其表达水平与患者生存期呈负相关;癌细胞PD-L1表达水平与浸润的CD8+T细胞数量相关,功能学实验提示PD-L1在肺癌细胞株上表达能够抑制T细胞体外增殖。(2)肺癌癌灶浸润巨噬细胞上高表达PD-L1,其表达水平与肿瘤淋巴结转移和临床分期呈正相关;荷瘤动物模型证实PD-L1表达与肿瘤进展密切相关;功能学实验也证实单核巨噬细胞上PD-L1可以抑制T细胞体外增殖。