白细胞介素-2（IL-2）是由活化的CD4+和CD8+T细胞产生的I型细胞因子，又称为T细胞生长因子。活化的树突状细胞（DCs）、天然杀伤（NK）细胞和NKT细胞也可以产生IL-2。IL-2是一个多功能的细胞因子，在淋巴细胞的稳态中具有非常重要的作用。IL-2可以诱导T细胞扩增以增强过继免疫治疗，在20世纪80年代被FDA批准用于治疗黑素瘤和肾细胞癌，但是由于IL-2在体内半衰期短，大约为15min，在治疗过程中每8h大约需要注射60,000–720,000IU/kg，因此，导致一些不良反应的出现。现在IL-2的研究热点集中于研究IL-2的突变体及低剂量的IL-2治疗自身免疫疾病方面。　　IL-2是一个多功能的细胞因子。低剂量的IL-2能够选择性的刺激Treg细胞的增殖，其治疗机制为Treg细胞表面能够表达高亲和力的IL-2受体（IL-2Rαβ）。在临床实验中，低剂量的IL-2在治疗系统性红斑狼疮（SLE），Ⅰ型糖尿病（T1D）等自身疾病方面已经取得很好的疗效，有望成为治疗自身免疫疾病的潜在药物。Teff细胞表面表达中等程度亲和力的受体，对高剂量的IL-2敏感。高剂量的IL-2能够诱导Teff细胞的增殖，用于治疗癌症和艾滋病（AIDS）等，但高剂量的IL-2在治疗过程中产生一系列的毒性，例如心律失常，呼吸困难和缺氧，肺水肿等。经过几十年的改进实践，高剂量IL-2的毒性作用显着改善，在逐步提高患者的安全性和舒适性。因此高剂量的IL-2对于患者仍然是有价值的治疗选择，并且在治疗转移性黑素瘤和其他癌症方面有显著潜力。　　IL-2信号传导在调节性T细胞（Treg）和效应T细胞（Teff）中是不同的。PTEN是一种脂质磷酸酶，可通过阻断磷脂酰肌醇转化为PIP3来负向调节PI3K，负调节此轴稳定Foxp3的表达。Treg细胞维持高水平的PTEN表达，从而阻止IL-2刺激后PI3K的下游活化，同时JAK-STAT信号传导被保留。这可能是IL-2介导CD4+CD25+T细胞的发育和存活而不能体外诱导有丝分裂反应的原因。与Teff细胞相比，Treg细胞具有更少量的mTOR刺激。事实上，Treg细胞的功能和存活不需要mTOR活性。除了PTEN，Treg细胞还表达程序性死亡受体1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4），两者都可以抑制PI3K/AKT途径。PD-1有两个配体：PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）。与其配体结合后，PD-1在其细胞内的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和基于免疫受体酪氨酸转换基序（ITSM）的酪氨酸残基被磷酸化。然后，PD-1募集蛋白酪氨酸磷酸酶—src同源2结构域酪氨酸磷酸酶2（SHP-2）到ITSM，并使PI3K去磷酸化。CTLA-4也可以抑制PI3K/AKT途径的活性，但其机制与PD-1不同，CTLA-4信号保留PI3K的活性，而是通过激活磷酸酶PP2A来抑制AKT活性。这可以解释为什么低剂量IL-2可以扩增Treg细胞并诱导免疫抑制来治疗自身免疫性疾病。　　20世纪80年代，IL-2被FDA批准用于治黑色素瘤和肾细胞癌，一些病人的症状得到缓解，但由于IL-2半衰期短，需要大量注射IL-2以维持其疗效，因此也引发一系列的副作用。2012年，Levin等通过体外进化技术设计IL-2的突变体，命名为H9，他们去除了IL-2对IL-2Rα的功能需求，增强其与IL-2Rβ的亲和力。与IL-2相比，H9能够更大程度的诱导细胞毒性T细胞的扩增，成比例的减少调节性T细胞的扩增，能够提高抗肿瘤免疫应答，并且在保证治疗作用的同时减小副作用。H9相对于野生型的IL-2突变了5个氨基酸：L80(F)，R81(D)，L85(V)，I86(V)，I92(F)。在2015年，Mitra在利用H9不依赖IL-2Rα这一性质，通过操作IL-2Rβ和IL-2R?的二聚化来设计IL-2的偏性拮抗剂，用于治疗自身免疫疾病。目前两种针对IL-2Rα的单克隆抗体Daclizumab和Basiliximab已被FDA批准，用于预防肾脏和心脏等器官移植排异以及治疗多发性硬化症。但是这些单克隆抗体不能阻断由中等程度亲和力的受体（IL-2Rβ）所引起的信号转导。基于这一问题，Mitra等在H9的基础上再突变一（Q126T）、二（L18R，Q22E）、三（L18R，Q22E，Q126T）、四（L18R，Q22E，Q126T，S130R）个氨基酸，分别命名为H9T，H9RE，H9RET，H9RETR。在增强与IL-2Rβ亲和力的基础上，降低其与IL-2R的亲和力，从而影响IL-2Rβ和IL-2R的二聚化来设计IL-2的偏性拮抗剂。我们的实验主要是探究IL-2及其突变体信号通路的异同，选择H9-RETR和H-9RE作为研究对象，为利用IL-2突变体治疗自身免疫疾病在信号通路方面奠定理论基础。　　采用western blot技术和质谱技术来研究IL-2及其突变体信号通路的异同。首先免疫共沉淀的技术获得信号复合体，将信号复合体在胰酶消化后通过质谱检测信号复合体成分。为了方便获得信号复合体，我们在目的蛋白的C末端添加一个flag标签，用anti-flag M2柱子沉淀信号复合体。野生型的IL-2添加flag标签后命名为SF-H2，H9RETR添加flag标签后命名为SF-H9RETR。我们设计SF-H2和SF-H9RETR基因序列后，全基因合成SF-H2和SF-H9RETR,采用重叠PCR获得目的基因后，将目的基因用NdeⅠ和HindⅢ进行酶切形成黏性末端，与被NdeⅠ和HindⅢ酶切后的pET30a连接，将此连接体系转化DH5α后通过菌落PCR、菌液PCR和质粒PCR筛选阳性菌落。将阳性菌落的质粒转化BL21，挑取边缘清晰，形态饱满的菌落通过培养后进行小样诱导。选取高表达目的蛋白的菌种扩大培养，由于pET30a含有His标签，我们采用镍柱纯化上清中的目的蛋白。纯化后目的蛋白通过western blot和质谱检测其正确性，之后通过设置不同浓度梯度的SF-H2和SF-H9RETR刺激CTLL-2细胞，用MTT法检测目的蛋白的活性，50ng/mL是SF-H2刺激细胞的最佳浓度。用50ng/mL的SF-H2和SF-H9RETR刺激CTLL-2细胞5min后，用冷的PBS终止信号，NP40裂解液裂解细胞后，得到总蛋白，western blot分析，发现SF-H2能够激活AKT/PI3K,RAS/MAPK,JAK/STAT5三条信号通路，SF-H9RETR不能明显激活信号，可能由于SF-H9RETR增强了与IL-2Rβ的亲和力，减弱了与IL-2R的亲和力，导致下游信号不能被明显激活。将细胞裂解后总蛋白经过免疫共沉淀技术获得信号复合体，用质谱检测信号复合体，结果没有检测到任何蛋白。我们推测为目的蛋白所带flag标签过少，因此Co-IP效率低，不能检测到信号复合体，这为我们之后的实验提供了很重要的依据。由于SF-H9RETR不能明显激活下游信号，因此可能为IL-2的潜在拮抗剂。　　根据文献可知IL-2在位于第58位的半胱氨酸（C58）和位于第105位的半胱氨酸（C105）之间形成二硫键，此二硫键的正确形成对IL-2的活性是非常重要的，位于第125位的半胱氨酸会影响此二硫键的正确形成，因此我们将IL-2第125位的半胱氨酸突变为丝氨酸，以此来提高IL-2的活性。由于SF-H9RETR不能明显激活下游信号通路，之后的实验中我们采用重组蛋白DF-H9CRE。实验中需要利用anti-flag珠子，采用免疫共沉淀技术将信号复合体沉淀，因此之后的实验中我们在目的蛋白的C末端添加两个flag标签，将目的蛋白命名为DF-H2C和DF-H9CRE。采用PCR技术获得小片段，然后将小片段利用重叠PCR技术得到目的基因。将目的基因通过NdeⅠ和HindⅢ酶切后与pET30a连接，连接体系转化DH5α后，通过菌落PCR，菌液PCR和质粒PCR筛选出阳性菌落。将阳性质粒转化BL21，进行小样诱导，筛选出高表达菌种，将该菌种大量扩培后，采用纯化包涵体中目的蛋白的方法，纯化DF-H2C和DF-H9CRE目的蛋白。纯化后采用western blot法孵育IL-2抗体检测目的蛋白的正确性以及质谱检测其序列的正确性。用不同浓度梯度的DF-H2C和DF-H9CRE分别刺激CTLL-2细胞，采用MTT法检测其增殖曲线，结果显示DF-H2C和DF-H9CRE都能明显刺激CTLL-2细胞的增殖，但DF-H9CRE的增殖曲线低于DF-H2C，并且都是50ng/ml时增殖曲线达到峰值为最佳刺激浓度。用50ng/mL的DF-H2C和DF-H9CRE分别刺激CTLL-2细胞5min后用冷的PBS终止信号，NP40裂解液裂解细胞后采用western blot法检测总蛋白中的信号强度。结果显示：DF-H2C和DF-H9CRE都能明显激活下游信号通路，但DF-H9CRE的信号强度弱于DF-H2C,与MTT结果一致。DF-H2C和DF-H9CRE分别刺激CTLL-2细胞5min后终止信号，采用anti-flag珠子将信号复合体沉淀，经过胰酶消化采用质谱检测信号复合体。在DF-H2C信号复合体中检测到DF-H2C，IL-2Rα，IL-2Rβ和JAK1；DF-H9CRE复合体中检测到DF-H9CRE，IL-2Rβ和JAK1。由于DF-H9CRE增加了与IL-2Rβ的亲和力，同时减弱了与IL-2R的亲和力，减弱IL-2Rβ和IL-2R的二聚化，进而减弱下游信号。由于DF-H9CRE与IL-2Rβ的亲和力强，相对于内源IL-2更易于IL-2的受体结合，因此可以作为IL-2的偏性拮抗剂，用于自身免疫疾病的治疗。　　我们的实验比较了SF-H2和SF-H9RETR以及DF-H2C和DF-H9CRE的信号通路异同，在IL-2激活的三条信号通路中，SF-H9RETR明显弱于SF-H2，DF-H9CRE明显弱于DF-H2C。且SF-H9RETR和DF-H9CRE增强了与IL-2Rβ的亲和力，相对于内源性IL-2更易于与IL-2的受体结合，因此有望成为IL-2的拮抗剂，用于阻断由中等程度亲和力的受体（IL-2Rβ）所引起的信号转导，为自身免疫疾病的治疗提供新的方向。