木质纤维素生物质代表了地球上最丰富的可再生资源,纤维素酶的广泛应用在对木质纤维素生物质的利用中具有重要意义,但对纤维素酶的高效表达和结构解析方面的报道并不多。本实验室从中国东海海域污泥中筛选分离得到一株黑曲霉(Aspergillus niger ZJUBE-1),其分泌的纤维素酶具有耐盐耐热等特性。本文以海洋黑曲霉ZJUBE-1为研究对象,对其分泌的纤维素酶的性质和结晶展开研究。主要研究内容和取得的结果如下:1.定点突变:通过同源建模模拟两种纤维素酶的三维结构和活性位点,再通过定点突变对活性位点进行验证,共获得了3个突变蛋白。2.分泌表达纤维素酶组分并进行酶学性质表征:通过定向表达的方法获得了两种海洋黑曲霉纤维素酶组分:内切葡聚糖酶EGL和纤维二糖水解酶CBH,分离纯化后获得了纯度高于95%的单一纤维素酶组分。然后对酶学性质进行研究,结果表明,内切葡聚糖酶具有耐酸、耐盐和耐热的特性。3.探索了蛋白质结晶方法并对纤维素酶的结晶条件进行筛选优化:以鸡蛋清溶菌酶、芽孢杆菌溶菌酶和人源溶菌酶作为模型酶,通过气相扩散座滴法探究了初始溶菌酶浓度、温度、pH值和结晶剂对三种来源溶菌酶结晶的影响。结果表明,鸡蛋清和芽孢杆菌溶菌酶的结晶条件是:蛋白质初始浓度为40 mg/ml,温度为25℃,pH值为5.5,结晶剂为0.1 M三水合乙酸钠,2.0 M甲酸钠;人源溶菌酶的结晶条件是:蛋白质初始浓度为80 mg/ml,温度为25℃,pH值为6.1,结晶剂为0.1 M BIS-TRIS,2M硫酸铵。此外,鸡蛋清溶菌酶、芽孢杆菌溶菌酶和人源溶菌酶形成的最理想晶型分别为四方块状、板块状和针状。利用气相扩散座滴法对高纯度纤维素酶组分进行了结晶条件的筛选与优化。结果显示,内切葡聚糖酶EGL在两种结晶条件下成功结晶,结晶条件分别为:0.2 M柠檬酸三铵、0.1 M 咪唑和 20%(w/v)PEG 2K-MME,pH 7.1;18%(v/v)异丙醇、0.1M柠檬酸二钠和20%(w/v)PEG 4000,pH 6.5,晶型分别为板块状和针状。总之,本文围绕海洋黑曲霉纤维素酶进行同源建模、定点突变、发酵、纯化、酶学性质表征和结晶,获得了纤维素酶的活性位点、高纯度发酵液和结晶条件,为纤维素酶的结构解析提供了思路,奠定了基础。