背景缺血/再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)后心肌细胞坏死、凋亡和心室重构是急性心肌梗死溶栓治疗和手术治疗后心功能不全的最主要病理生理学基础。研究发现,急性心肌缺血发生后最终的心肌梗死面积大约50%是由IRI所致。合并糖尿病时更容易发生心肌IRI,且心脏损伤程度和病死率均进一步明显增加,严重威胁人类生命健康,但机制尚不明确。探讨可能的保护措施以达到预防或减轻心肌IRI的目的,为临床糖尿病合并缺血性心肌病患者的防治提供理论依据,具有良好的应用前景。缺血预处理(Ischemic preconditioning,IPC)是指通过多次短暂冠状动脉缺血以达到增强心肌对随后长时间缺血的耐受性,从而减轻心肌IRI。IPC强大的心肌保护作用主要表现为缩小IRI后心肌梗死面积、降低心律失常的发生率、减少心肌细胞凋亡和促进心功能恢复等。IPC在IRI中发挥的作用备受人们关注,但其调动心肌内源性保护作用的机制至今尚未被完全阐明。自噬(Autophagy)是一种细胞内防御和应激调控机制,也是参与心肌IRI的重要机制之一。作为一种重要的物质代谢方式,自噬的发生和发展均受到严格的调节和控制。自噬是由自噬相关基因(Autophagy related gene,Atg)进行调控,其中参与调节的几个关键蛋白复合物包括雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷脂酰肌醇 3 激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase,PI3K)、Atg8(LC3)和Atg6(Beclin-1)等。目前已知的自噬调节途径有多条,其中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(Protein kinase B)-雷帕霉素靶蛋白信号转导通路(PI3K-Akt-mTOR信号转导通路)是自噬过程中唯一的抑制性通路。现有的证据表明,自噬在IRI过程中的作用存在双面性,发挥保护作用还是损伤作用目前尚存在争议。糖尿病严重威胁人类的生命健康,不仅是缺血性心脏病的独立危险因子,而且能够加重心肌IRI和使IPC等干预措施对心肌IRI的保护作用消失或减弱。研究发现,自噬及其相关的PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在糖尿病心肌的表达发生了明显改变,而且它们在正常和糖尿病心肌IRI中所发挥的作用并不相同。由此可见糖尿病心肌IRI与自噬及其相关PI3K-Akt-mTOR信号转导通路关系密切,但具体机制和它们之间的相互作用有待进一步的阐明和研究。基于上述分析,我们设计了这个基础实验研究,旨在从离体和在体实验两个层面观察PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在正常和糖尿病心肌IRI的表达情况,探讨PI3K-Akt-mTOR信号转导通路和自噬在糖尿病心肌IRI中的作用。同时,在糖尿病心肌IRI实施IPC时分别应用自噬激动剂和抑制剂进行干预,观察其是否影响IPC对糖尿病心肌IRI的保护作用,以进一步探讨自噬调节在糖尿病心肌IRI保护机制中的作用。本实验共分四个部分:第一部分:心肌细胞缺氧/复氧损伤模型和缺氧预处理模型的建立本部分实验的目的是构建成熟、稳定且高质量的原代心肌细胞培养方法,采用三气培养箱培养构建新生鼠离体心肌细胞缺氧/复氧(Anoxia/reoxygention,AR)损伤模型,并在此基础上通过观察心肌细胞凋亡情况,探索最佳的缺氧预处理方式。采用三气培养箱培养构建新生大鼠离体心肌细胞缺氧预处理模型。心肌细胞培养72h后,随机分为5组:①空白对照组(S组):心肌细胞正常培养不进行任何处理;②3h/6h组:心肌细胞进行缺氧3h和复氧6h处理;③30min*3h/6h组:心肌细胞进行缺氧30 min和复氧30 min的缺氧预处理,再进行缺氧3 h和复氧6 h处理;④6h/6h组:心肌细胞进行缺氧6h和复氧6h处理;⑤30min*6h/6h组:心肌细胞进行缺氧30 min和复氧30 min的缺氧预处理,再进行缺氧6 h和复氧6 h处理。采用cTnT免疫荧光法复合细胞核DAPI染色法鉴定心肌细胞的纯度,采用乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)检测试剂盒检测各组心肌细胞LDH漏出率,采用膜联蛋白 V(AnnexinV)/碘化丙啶(Propidine iodide,PI)(AnnexinV/PI)双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况。结果显示,倒置相差显微镜下观察,48～72 h后心肌细胞出现同步化搏动,形成功能上的合胞体、收缩有力、活性高。cTnT免疫荧光法复合细胞核DAPI染色法鉴定的心肌细胞纯度达到(94.4±1.2)%。与S组相比,各处理组的心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均明显升高,正常细胞百分比明显降低。与3h/6h组相比,6h/6h组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均明显升高,正常细胞百分比明显降低;30min*3h/6h组,心肌细胞LDH漏出率明显降低,正常细胞百分比明显升高。与6h/6h组相比,30min*6h/6h组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均明显降低,正常细胞百分比明显升高。第二部分:自噬和PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在缺氧预处理对高糖心肌细胞缺氧/复氧损伤保护中作用的实验研究本部分实验目的是观察自噬及其相关PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在正常和高糖培养心肌细胞缺氧预处理中的表达,旨在探讨缺氧预处理对高糖心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用的改变及其相关机制。心肌细胞培养72h后进行如下分组:①正常空白对照组(S组):正常培养基(糖浓度为5.5 mmol/L,下同)培养的心肌细胞,持续培养12h;②高糖空白对照组(HS组):高糖培养基培养(糖浓度为30mmol/L,下同)的心肌细胞,持续培养12 h;③正常缺氧/复氧损伤组(C组):正常心肌细胞接受缺氧6 h和复氧6 h处理;④高糖缺氧/复氧损伤组(HC组):高糖心肌细胞接受缺氧6 h和复氧6 h处理;⑤正常缺氧预处理组(HPC组):正常心肌细胞进行缺氧30 min和复氧30 min的缺氧预处理,再进行缺氧6 h和复氧6 h处理;⑥高糖缺氧预处理组(HHPC组):高糖心肌细胞进行缺氧30 min和复氧30 min的缺氧预处理,再进行缺氧6 h和复氧6 h处理。采用LDH检测试剂盒检测心肌细胞LDH漏出率,采用Annexin V/PI双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况,采用Western-blotting法检测LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR、PI3K 和 P-Akt/Akt 表达情况。结果显示:与C组相比,HPC组的心肌细胞LDH漏出率明显降低(P<0.01)。与HC组相比,HHPC组的心肌细胞LDH漏出率无显著统计学差异(P>0.05)。与HPC组相比,HHPC组的心肌细胞LDH漏出率明显升高(P<0.01)。与C组相比,HPC组的心肌细胞早期和晚期凋亡细胞百分比均明显降低,正常细胞百分比明显升高(P<0.05)。与HC组相比,HHPC组的心肌细胞早期凋亡细胞百分比、晚期凋亡细胞百分比和正常细胞百分比均无显著统计学差异(P>0.05)。与HPC组相比,HHPC组早期和晚期凋亡细胞百分比均明显升高(P<0.01)。与S组相比,各处理组心肌细胞LC3-Ⅱ表达明显升高(P<0.05),mTOR和PI3K表达明显降低(P<0.05);HS组、C组、HC组和HHPC组的Beclin-1表达明显升高(P<0.05),P-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05)。与C组相比,HPC组心肌细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表达明显降低(P<0.05),mTOR表达明显升高(P<0.05);HC组Beclin-1表达明显升高(P<0.05),mTOR表达明显降低(P<0.05),LC3-Ⅱ表达有升高趋势但无显著统计学差异(P>0.05)。与HC组相比,HHPC组mTOR表达明显升高(P<0.05),PI3K表达明显降低(P<0.05)。与HPC组相比,HHPC组LC3-Ⅱ和Beclin-1表达明显增加(P<0.05),mTOR、PI3K表达和P-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05)。第三部分:缺血预处理对正常和糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的保护作用和机制本部分实验旨在观察自噬在正常和糖尿病心肌IRI后的表达水平,比较IPC对正常和糖尿病心肌IRI的影响,探讨自噬在其中的作用。将30只正常和30只糖尿病成年雄性Sprague DawLey(SD)大鼠(体重350～450g)随机分为六组:正常空白对照组(S组)、糖尿病空白对照组(DS组)、正常IRI组(C组)、糖尿病IRI组(DC组)、正常IPC组(IPC组)和糖尿病IPC组(DIPC组)。所有大鼠开胸后采用5-0丝线将冠状动脉左前降支(Left anterior descending coronary artery,LAD)套扎做成活结。S组和DS组不采取任何干预处理措施,持续观察150min。C组和DC组接受局部心肌缺血30 min(阻断LAD)和再灌注120 min(开放LAD)的处理。IPC组、DIPC组在IRI前进行3个循环的IPC,每个循环是由5 min的LAD阻断和5 min的LAD开放组成,总处理时间是30 min。整个实验过程中,连续监测Ⅱ导联心电图(ECG)、平均动脉压(Mean artery presure,MAP)和心率(Heartrate,HR),并保持大鼠肛温在36.5～37.5℃之间。在再灌注120min时抽取血标本,采用大鼠专用试剂盒分别测定血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac troponin-Ⅰ,cTnI)浓度和CK-MB浓度。随后采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑双重染色检测心肌梗死面积(Infarct size,IS%)。采用Western-blotting法检测 LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR、PI3K 和 P-Akt/Akt 表达情况。结果显示,各组大鼠的一般情况、心肌缺血前血流动力学参数基础值比较差异均无显著统计学意义。在缺血期和再灌注期,与C组相比,IPC组发生室性心律失常的大鼠数目明显减少,并且室性心律失常评分降低,DC组发生室性心律失常的大鼠数目明显增多,并且室性心律失常评分增高。与DC组相比,DIPC组发生室性心律失常的大鼠数目和室性心律失常评分无明显差异。与S组相比,C组和DC组IS%明显升高(P<0.05)。与C组相比,IPC组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS%明显降低(P<0.05),DC组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS%有升高趋势,但无显著统计学差异(P>0.05)。与DC组相比,DIPC组的血清cTnI和CK-MB浓度以及IS%无显著统计学差异(P>0.05)。与IPC组相比,DIPC组的血清cTnI和CK-MB浓度以及IS%明显升高(P<0.05)。与S组相比,各处理组缺血区心肌组织Beclin-1表达均明显升高(P<0.05),mTOR表达均明显降低(P<0.05)。与C组相比,DC组缺血区心肌组织的LC3-Ⅱ和Beclin-1表达明显升高(P<0.05);IPC 组的 LC3-Ⅱ和 Beclin-1 表达明显降低(P<0.05),mTOR、PI3K表达和P-Akt/Akt比值明显升高(P<0.05)。与DC组相比,DIPC组缺血区心肌组织LC3-Ⅱ、Beclin-1、mTOR、PI3K和Akt表达均无显著统计学差异(P>0.05)。与IPC组相比,DIPC组缺血区心肌组织LC3-Ⅱ表达明显升高(P<0.05),mTOR表达和P-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05)。第四部分:自噬和PI3K-Akt-mTOR信号转导通路在缺血预处理对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤保护中作用的实验研究根据第三部分的研究结果,IPC对正常心肌IRI具有保护作用,而对糖尿病心肌IRI无明显保护性作用,因此设计了这部分实验,在IPC中分别采用自噬激动剂(雷帕霉素)和抑制剂(渥曼青霉素)进行干预,观察PI3K-Akt-mTOR信号转导通路和自噬的改变,旨在评价在自噬干预情况下IPC能否对糖尿病心肌IRI产生保护作用。将60只成年雄性糖尿病SD大鼠(体重350～450 g)随机分为六组:①糖尿病空白对照组(DS组):建模30 min前腹腔注射生理盐水1.5 ml,在LAD下方穿5-0缝合线但不结扎,持续150 min。②糖尿病IRI对照组(DC组):建模30 min前腹腔注射生理盐水1.5 ml,成功建立在体心肌缺血/再灌注损伤模型后稳定10 min,结扎LAD 30 min,然后开放LAD实施再灌注120 min。③雷帕霉素+糖尿病IRI组(Ra+DIPC组):建模前30 min腹腔注射雷帕霉素0.25 mg/kg(溶液总体积1.5 ml),成功建立在体心肌缺血/再灌注损伤模型后稳定10 min,结扎LAD 30 min,然后开放LAD实施再灌注120 min。④渥曼青霉素+糖尿病IRI组(Wo+DIRI组):建模前30 min腹腔注射渥曼青霉素0.6 mg/kg(溶液总体积1.5 ml),余操作同Ra+DIRI组。⑤雷帕霉素+糖尿病IPC组(Ra+DIPC组):糖尿病大鼠建模前30 min腹腔注射雷帕霉素0.25 mg/kg(溶液总体积1.5 ml),成功建立心肌IRI模型后稳定10min,结扎LAD前进行3个循环IPC,每个循环是由5 min的LAD阻断和5 min的LAD开放组成,总处理时间是30 min;然后,结扎LAD 30 min,再开放LAD实施再灌注120 min;⑥渥曼青霉素+糖尿病IPC组(Wo+DIPC组):建模前30 min腹腔注射渥曼青霉素0.6 mg/kg(溶液总体积1.5 ml),余操作同Ra+DIPC组。检测方法同第三部分。结果显示,各组大鼠的一般情况、心肌缺血前血流动力学参数的基础值比较差异均无显著统计学意义。与DS组相比,各处理组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显升高(P<0.05)。与DC组相比,Wo+DIPC组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低(P<0.05);Wo+DIRI组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均有降低趋势,但无统计学意义(P>0.05);Ra+DIRI组和Ra+DIPC组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均无显著差异(P>0.05)。与 Ra+DIRI 组相比,Wo+DIRI 组和 Ra+DIPC 组 IS%值、血清 cTnI 和 CK-MB浓度均无显著差异(P>0.05);但在Wo+DIPC组中明显降低(P<0.05)。与Wo+DIRI组相比,Wo+DIPC组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低(P<0.05)。与Ra+DIPC组相比,Wo+DIPC组IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低(P<0.05)。与DS组相比,DC组和Ra+DIRI组缺血区心肌组织LC3-Ⅱ和Beclin-1表达明显升高(P<0.05),mTOR和PI3K表达和P-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05);Wo+DIRI组LC3-Ⅱ表达明显升高,P-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05)。与DC组相比,Ra+DIRI组LC3-Ⅱ表达明显升高(P<0.05),PI3K表达明显降低(P<0.05);Wo+DIRI 组 PI3K 表达和 P-Akt/Akt 比值明显升高(P<0.05)。与DC组相比,Ra+DIPC组LC3-Ⅱ表达明显升高(PP<0.05);而Wo+DIPC组Beclin-1表达明显降低(P<0.05),mTOR、PI3K表达和P-Akt/Akt比值明显升高(P<0.05)。与 Ra+DIPC 组相比,Wo+DIPC 组 LC3-Ⅱ和 Beclin-1 表达明显降低(P<0.05),mTOR、PI3K表达和P-Akt/Akt比值明显升高(P<0.05)。结论1.通过缺氧6 h/复氧6 h能够成功构建离体心肌细胞缺氧/复氧损伤模型;缺氧30 min/复氧30 min后再进行缺氧6 h/复氧6 h能够成功构建离体心肌细胞缺氧预处理模型。2.高糖培养和缺氧/复氧损伤均可导致心肌细胞自噬抑制性通路PI3K-Akt-mTOR信号转导通路表达减弱和自噬相关激动蛋白表达增强。3.缺氧30 min/复氧30 min的缺氧预处理可对正常培养心肌细胞的缺氧/复氧损伤产生保护作用,且使PI3K-Akt-mTOR信号转导通路表达明显增强;但缺氧预处理对高糖培养心肌细胞缺氧/复氧损伤无明显保护作用,且不影响PI3K-Akt-mTOR信号转导通路表达。4.心肌IRI和糖尿病均可抑制自噬抑制性通路(PI3K-Akt-mTOR信号转导通路),增强心肌细胞自噬表达水平。5.IPC对正常心肌IRI具有保护作用,但对糖尿病心肌IRI无明显保护作用,这可能是与糖尿病心肌组织自噬表达增强有关。6.渥曼青霉素干预可改善IPC对糖尿病心肌IRI的保护作用,这与渥曼青霉素激活PI3K-Akt-mTOR信号转导通路和降低自噬表达水平有关。