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研究背景牙髓病和根尖周病是最常见的口腔疾病,通过摘除病变牙髓并用人工合成材料修复组织缺损是目前主要的治疗方法。但这些材料具有局限性,不能完全恢复组织的功能。随着组织工程再生医学的发展,牙髓再生已成为一种理想的治疗方法。人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）是目前最常用的种子细胞,在牙髓再生中发挥着重要的作用。尽管许多学者已经在研究如何实现hDPSCs成牙本质向分化,但确切的分子机制尚未得到。因此,如果能找到一种新的生物学标志物,揭示hDPSCs成牙本质向分化的分子机制,对牙髓再生有着重要的意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种特殊的非编码RNA,研究发现circRNA不仅分布广泛、保守性高、在组织细胞中特异性表达、还可以调节胚胎干细胞的多能性和分化能力。因此,circRNA被学者们认为是理想的疾病诊断标志物和治疗靶点,有重要的研究意义和临床应用价值。但目前hDPSCs成牙本质向分化过程中circRNA的研究鲜有报道。本课题旨在研究circRNA对hDPSCs成牙本质向分化的作用,为将来牙髓再生提供新思路。研究目的1.明确hDPSCs矿化诱导前后circRNA的表达水平。2.利用生物信息学分析基因芯片结果并构建circRNA-miRNA-mRNA网络图。3.初步探索hsacirc0001599对hDPSCs成牙本质向分化的影响。材料与方法1.采用改良酶组织块消化法分离培养hDPSCs,并鉴定其生物学特性。2.采用基因芯片技术分析矿化诱导前后hDPSCs中circRNA表达变化水平,通过定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）技术对结果进行验证。接着利用生物信息学方法对基因芯片结果进行分析,并构建circRNA-miRNA-mRNA的内源性竞争RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）网络,筛选出在hDPSCs成牙本质向分化过程中的关键circRNA。3.构建hsacirc0001599 shRNA慢病毒并沉默其表达,同时检测其对hDPSCs成牙本质向分化的能力。结 果1.改良酶组织块消化法分离培养出hDPSCs,单克隆实验检测其具有克隆形成能力;CCK8试剂检测其生长状态良好;矿化、成脂及成软骨诱导实验证明其有多向分化能力;流式检测结果示,阳性表达间充质干细胞表面标记物CD29（99.96%）,CD44（99.99%）,CD90（99.99%）和 Stro-1（18.39%）。2.基因芯片结果筛选出差异表达的187个circRNAs,其中43个上调、144个下调（变化倍数≥1.5或≤-1.5,P<0.05）,qRT-PCR结果与芯片结果一致。生物信息学结果示,显著差异表达的circRNAs的靶基因与细胞通讯、信号转导等多个生物学过程相关,并参与调节了 Wnt、TGF-β等信号通路。ceRNA网络图结果示,差异表达的circRNA与miRNA及成牙本质向分化相关mRNA之间可能存在潜在调控关系。3.成功构建sh-circ1599慢病毒并转染细胞,ALP染色及茜素红染色结果示,矿化诱导7d后,hsacirc0001599干扰慢病毒组细胞的ALP活性降低、矿化结节形减少。qRT-PCR与Western Blot结果示沉默hsacirc0001599表达会抑制成牙本质/成骨相关基因牙本质涎磷蛋白（Dentin sialophosphoprotein,DSPP）、牙本质基质蛋白（Dentinmatrixprotein,DMP）-1、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（Osteocalcin,OCN）的表达。结 论1.本实验从人牙髓组织中经组织块酶消化法分离纯化出的细胞,高表达间充质干细胞表面标记物,证明其为间充质来源。且具有克隆形成能力及多向分化能力,可确定为hDPSC。2.hDPSCs成牙本质向分化过程中确实存在着大量circRNA的差异表达。利用生物信息学初步分析示,差异表达的circRNA靶基因参与多种与hDPSCs成牙本质向分化相关的信号通路,并且可能存在circRNA-miRNA-mRNA调控网络。3.沉默hsacirc0001599表达时,hDPSCs的成牙本质向分化能力受到抑制,证明hsa circ0001599可以促进hDPSCs成牙本质向分化。