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第一部分NEK2在肝细胞肝癌组织中的表达及其与临床预后的关系目的观察NEK2在肝细胞肝癌(HCC)组织及癌旁肝组织中的表达情况,初步探讨NEK2在HCC发生、发展中的作用。方法1.Oncomine数据库分析NEK2在HCC中的mRNA表达情况;2.免疫组化(IHC)检测HCC中NEK2蛋白水平的表达及其与临床病理参数之间的关系。结果Oncomine数据库显示NEK2 mRNA水平在HCC中的表达高于癌旁肝组织。IHC检测40例HCC和癌旁肝组织,发现NEK2的表达主要定位于细胞质和细胞核上,40例肝癌患者标本中有23例呈高表达(57.5%),而癌旁中仅有3例呈高表达(7.5%),说明NEK2在蛋白表达水平上肝癌组织高于癌旁肝组织。收集分析136例HCC相关临床病理资料,在肿瘤组织中NEK2的高表达与HCC患者的肿瘤大小(P=0.002)、TNM分期(P=0.028)及癌栓有无(P=0.039)呈正相关(均P<0.05)。Kaplan-Meier法发现NEK2高表达患者总生存率(P<0.01)与无瘤生存率(P<0.05)比低表达者要差。Cox的单因素和多因素分析均显示NEK2在肝癌组织中的高表达是影响患者预后的独立因素。结论1.NEK2 mRNA和蛋白的表达水平在肝癌组织中高于癌旁肝组织;2.肝癌组织中NEK2高表达与肝癌的大小、TNM分期和癌栓呈正相关;3.NEK2高表达是影响肝癌预后的独立因素。第二部分NEK2对肝癌细胞增殖、凋亡及周期的影响目的研究NEK2对肝癌细胞增殖、凋亡及周期的影响。方法1.Real-time PCR比较NEK2在肝癌细胞株与肝细胞株的表达情况;2.采用 siNEK2 转染肝癌 HCCLM3 和 Hep-3B 细胞,Real-time PCR 和 Western blot检测转染后NEK2 mRNA和蛋白的表达变化;3.siNEK2沉默HCCLM3和Hep-3B细胞中的NEK2表达后,MTS法和单克隆形成实验检测肝癌细胞增殖以及流式细胞学技术检测细胞凋亡和周期的变化。结果在Hep-G2,Hep-3B,HuH-7,SMMC7721,HCCLM3,Snu387和Snu475共7株肝癌细胞株中,Real-time PCR显示NEK2在mRNA表达水平上均高于肝细胞株Chang liver。采用 siNEK2转染肝癌HCCLM3和Hep-3B细胞,Real-time PCR和Western blot显示转染后的NEK2 mRNA(P<0.001)和蛋白均明显下调。MTS法(P<0.05)和单克隆形成实验(P<0.01)显示siNEK2可以抑制肝癌细胞的增殖。与对照组相比,siNEK2转染48 h后,流式细胞学技术发现发生凋亡的肝癌细胞增加(P<0.05),Western blot发现BAD和C-caspase-3的表达上调,而抗凋亡蛋白BCL-2的表达下调;流式细胞学技术分析HCCLM3和Hep-3B的细胞周期,发现siNEK2使处于G2/M期的细胞比例减少(P<0.05),细胞内CyclinB1和CDK1的蛋白表达水平下降,P27的蛋白表达水平上调。结论1.化学合成的siNEK2能够有效的下调NEK2在肝癌细胞株HCCLM3和Hep-3B细胞中的表达水平;2.siNEK2后能够抑制肝癌细胞的增殖能力,促进肝癌细胞凋亡和抑制细胞有丝分裂。第三部分NEK2在维持肝癌肿瘤干细胞自我更新能力和化疗药物耐药的作用目的研究NEK2在维持肝癌肿瘤干细胞自我更新能力和化疗药物耐药的作用。方法1.用单克隆形成实验和细胞微球形成实验检测siNEK2对HCCLM3和Hep-3B细胞自我更新能力的影响,CCK-8检测siNEK2后细胞对化疗药物敏感性的变化;2.Western blot检测siNEK2后HCCLM3和Hep-3B肿瘤干细胞标记物的变化;3.Real-time PCR 和 Western blot 检测 siNEK2 后在 HCCLM3 和 Hep-3B 细胞中Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin及其靶基因的变化。结果与转染对照组相比,单克隆形成实验显示siNEK2组肿瘤细胞的单克隆形成能力明显下降(P<0.01),微球形成实验亦显示siNEK2组HCCLM3(P<0.001)和Hep-3B(P<0.01)细胞的微球形成能力明显低于对照组。CCK-8检测发现siNEK2组肝癌细胞对5-Fu和Cisplatin药物敏感性明显高于对照组(P<0.05)。Western blot显示肿瘤干细胞标记物Nanog、Sox2和Bmi1的蛋白表达水平,siNEK2组较对照组明显下降。Western blot在显示siNEK2后Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin降低的同时,Real-timePCR发现β-catenin入核调节肿瘤干细胞的靶基因EpCAM、c-Myc和CD133也明显下降(P<0.01)。Wnt3a是Wnt/β-catenin信号通路的激动剂,在siNEK2组细胞中加入Wnt3a,发现Wnt3a可以部分恢复因siNEK2受抑制的细胞微球形成能力(P<0.01)。结论1.siNEK2后能够抑制肝癌细胞HCCLM3和Hep-3B的肿瘤干细胞特性,包括微球形成能力和化疗药物耐药性;2.NEK2对肝癌肿瘤干细胞特性的作用,包括维持自我更新能力和化疗药物的耐药,可能是通过Wnt/β-catenin信号通路实现的。