【摘 要】
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4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)是一种极具应用前景的Ⅱ型糖尿病治疗药物。在课题组前期研究中,将异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)编码基因ido导入异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum SN01中表达,利用内源生成的异亮氨酸合成4-HIL。本研究主要内
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4-羟基异亮氨酸（4-hydroxyisoleucine,4-HIL）是一种极具应用前景的Ⅱ型糖尿病治疗药物。在课题组前期研究中,将异亮氨酸双加氧酶（L-isoleucine dioxygenase,IDO）编码基因ido导入异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum SN01中表达,利用内源生成的异亮氨酸合成4-HIL。本研究主要内容为改造并筛选异亮氨酸生物传感器Lrp-PbrnFE（Leucine-responsive regulator protein,Lrp）中的PbrnFE启动子,利用不同的PbrnFE启动子动态调控ido的表达以及动态调节α-酮戊二酸和氧气的供应,来提高4-HIL产量。主要研究内容和结果如下:（1）表征Lrp-PbrnFE生物传感器对异亮氨酸的灵敏度和调控范围,它对异亮氨酸的响应范围为1—10 m M,激活倍数从1.40倍到2.30倍,激活后的PbrnFE启动子的强度仍比Ptac M启动子低52.14—70.70%。（2）针对Lrp-PbrnFE生物传感器构建PbrnFE启动子突变文库,并利用四环素外排蛋白（Tet A）筛选标记进行遗传双选,得到5个突变型PbrnFE启动子,命名为PbrnFE1,PbrnFE5,PbrnFE7,PbrnFE9和PbrnFE13,经1 m M异亮氨酸诱导后,它们的激活倍数分别达到3.60倍、4.00倍、5.61倍、2.39倍和2.36倍。（3）采用天然型和5个突变型PbrnFE启动子构建动态调控ido表达的6个不同质粒plrp-PbrnFEN-ido,并转化到SN01中,得到菌株ST01—ST06。相对于天然启动子控制的ST01菌株,5个突变启动子调控菌株的4-HIL产量均提高,其中SN01/plrp-PbrnFE7-ido即ST04的4-HIL产量最高,达到74.40 m M,比ST01的产量提高201.70%。（4）在菌株ST04基础上动态供应α-酮戊二酸,利用PbrnFE、PbrnFE1和PbrnFE7启动子分别动态调控α-酮戊二酸脱氢酶抑制蛋白（Odh I）表达,构建三个双动态菌株ST07—ST09,三株菌的4-HIL产量均低于对照菌株ST04,原因可能是氧气供应不足。（5）在菌株ST07、ST08和ST09的基础上增强菌株的摄氧速率,利用PbrnFE、PbrnFE1和PbrnFE7启动子分别动态调控透明颤菌血红蛋白（VHb）表达,构建3×3个三动态菌株ST10—ST17。这些三动态菌株的4-HIL产量均高于对应的双动态菌株,其中菌株SN01/plrp-PbrnFE7-ido-PbrnFE7-odh I-PbrnFE7-vgb即ST17的4-HIL产量最高,达到135.34 m M,比最佳的单动态菌株ST04的产量提高81.91%。这些结果表明动态供应α-酮戊二酸和氧气能大幅提高4-HIL产量。
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