目的为评价营养改良型转高赖氨酸基因水稻、转人乳铁蛋白基因水稻的食用安全性,采用营养成分分析、动物喂养实验等方法,观察转基因水稻对动物机体的生长发育、消化代谢、亚慢毒性、营养与健康状况等的影响,从不同的角度对转基因水稻进行食用安全性评价；为评价抗虫转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)水稻中外源蛋白的食用安全性,利用大肠杆菌原核表达系统重组表达CpTI蛋白,为进一步的毒性、致敏性评价研究奠定基础。材料与方法1.转高赖氨酸基因水稻的食用安全性评价营养成分比较对转高赖氨酸基因水稻和亲本水稻的蛋白质、碳水化合物、脂肪、纤维素、维生素和矿物质等进行测定,比较转基因水稻与亲本水稻在主要营养成分上是否具有显著差异。主要营养素的体内消化代谢研究选取8头10月龄成年去势五指山小型公猪,适应喂养7天(期间驱虫处理)后进行回肠造瘘手术。术后恢复2周,选择其中恢复良好的6头小型猪进行试验。以Cr2O3为指示剂掺入饲料,亲本大米饲料为对照,采用重复拉丁方设计饲喂大米饲料。每种饲料适应喂养4天后连续收集3天食糜,最后统一饲喂5%酪蛋白饲料测定内源性氨基酸排出量。将收集的食糜混匀、冷冻干燥、过筛,测定食糜中主要营养素的含量(蛋白质/氨基酸、碳水化合物、脂肪、纤维素),计算和比较各种营养素的消化率。采用氨基酸评分(AAS)和经蛋白质消化率校正的氨基酸评分(PDCAAS)评价大米中蛋白质的质量。亚慢毒性评价(90天喂养实验)选取初断乳Wistar大鼠60只,雌雄各半,体重60-75g。大鼠于SPF级动物房单笼饲养,自由饮水、进食。适应喂养7d后按体重随机分为3组,分别饲喂转基因大米饲料(HL5组)、非转基因亲本大米对照饲料(WT组)和AIN-93G配方对照饲料(AIN对照组)。每周记录体重1次,进食量2次。实验中期和实验结束时各检测血常规和血生化1次。实验结束后处死大鼠,取右股骨测量骨密度；取脑、心、肝、脾、肾、肾上腺、睾丸、胸腺称重,计算脏器系数；对上述脏器及肺、胃、甲状腺、十二指肠、子宫、附睾、卵巢和前列腺等进行病理学检查。2.转人乳铁蛋白基因水稻的食用安全性评价营养成分比较对转人乳铁蛋白基因水稻和亲本水稻的蛋白质、碳水化合物、脂肪、纤维素、维生素和矿物质等进行测定,比较两种水稻在主要营养成分上是否存在显著差异。主要营养素的体内消化代谢研究6头已安装T型瘘管的成年去势五指山小型公猪为实验动物,Cr203为指示剂掺入饲料。两种大米饲料分别适应喂养4天后连续3天收集食糜,5%酪蛋白饲料用于测定内源性氨基酸排出量。将收集的食糜样品混匀、冷冻干燥、过筛,测定和和比较两种水稻主要营养素的消化率。试验结束处死小型猪,取瘘管安置处及上、下端的肠段进行病理检测。采用AAS和PDCAAS法评价大米中蛋白质的质量。亚慢毒性评价(90天喂养实验)初断乳Wistar大鼠80只,雌雄各半,体重60-75g。大鼠于SPF级动物房单笼饲养,自由饮水、进食。适应喂养7d后按体重随机分为4组,分别饲喂转基因高剂量大米饲料(hLF高剂量组)、转基因中剂量大米饲料(hLF中剂量组)、非转基因亲本大米对照饲料(PR组)和AIN-93G配方对照饲料(AIN对照组)。每周记录体重1次,进食量2次。实验中期和实验结束时各检测血常规和血生化1次。实验结束后处死大鼠,取右股骨测量骨密度；取内脏称重,计算脏器系数；并对主要脏器进行病理学检查。营养学评价(28天喂养实验)采用蛋白质功效比值(PER)法评价转基因水稻的营养价值。初断乳Wistar大鼠80只,雌雄各半,体重55-65g,于SPF动物房中单笼饲养。根据PER法要求,以大米中蛋白质最大掺入为原则,并使各组饲料的蛋白质含量达到10%配制饲料。大鼠适应喂养7d后按体重随机分为4组,分别饲喂转基因高剂量大米饲料(hLF高剂量组)、转基因中剂量大米饲料(hLF中剂量组)、非转基因亲本大米对照饲料(PR组)和酪蛋白对照饲料(酪蛋白对照组),每周记录体重1次,进食量2次。结束时检测血常规、血生化、骨密度,计算和比较各组的PER值。3.豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)蛋白的表达纯化融合表达纯化将CpTI基因序列与pTWIN2载体进行重组构建(pTWIN2-CpTI),诱导表达CpTI基因与内含肽、几丁质形成的融合蛋白,通过几丁质柱层析、温度和pH值的变化诱导内含肽的肽键裂解,释放出目标蛋白；将CpTI基因序列与pPAL7载体进行重组构建(pPAL7-CpTI),诱导表达CpTI基因与Profinity eXact标签形成的融合蛋白,通过亲和层析纯化获得目标蛋白。非融合表达纯化利用PET41EK/LIC载体进行非融合表达,切除载体上的GST标签并将CpTI基因序列与载体进行重组构建,获得能表达天然CpTI蛋白的载体PET41EK-CpTI,对诱导表达条件、离子交换纯化条件等进行优化,获得无多余氨基酸残基的目标蛋白。结果1.转高赖氨酸基因水稻的食用安全性评价转高赖氨酸基因水稻与亲本水稻在主要营养成分上没有显著差异。主要营养素体内消化代谢实验结果表明转高赖氨酸基因水稻与亲本水稻在动物营养代谢利用率上没有显著差异。转基因水稻既不会影响动物体内蛋白质和氨基酸的正常消化代谢,也不会干扰其他营养素的消化代谢,不影响动物正常的生长发育代谢。转高赖氨酸基因水稻GT3、HL5及亲本水稻的AAS分别为47.82%、65.11%、56.44%,PDCAAS分别为53.45%、67.49%、58.70%。亚慢毒性评价结果表明,转高赖氨酸基因大米组与两个对照组在进食量、体重增长上没有显著差异(P>0.05)。血常规(PLT、GRN、RBC、MCH、LYM)、血生化(GLU、LDLC)、脏器系数(脑/体、肾脏/体、脾脏/体)、骨密度的个别指标与对照组之间有显著差异(P<0.05)。对比存在差异的指标,大部分在数值上的差异并不大,仅有统计学差异,且各项指标基本在文献报道的正常范围内。病理学检查未发现明显异常。2.转人乳铁蛋白基因水稻的食用安全性评价转人乳铁蛋白基因水稻与亲本水稻在乳铁蛋白、赖氨酸、铁元素等特定营养成分上存在显著差异。主要营养素体内消化代谢实验结果表明转人乳铁蛋白基因水稻中主要营养素在小型猪体内的消化代谢与亲本水稻没有显著差异(P>0.05),不会干扰动物的正常消化代谢,也不影响动物正常的生长发育代谢。转人乳铁蛋白基因水稻与亲本水稻的AAS分别为50.27%,53.24%,PDCAAS分别为54.06%,52.66%。亚慢毒性评价结果显示,转人乳铁蛋白基因大米组与两个对照组在进食量、体重增长上没有显著差异(P>0.05),高剂量组和中剂量组之间也没有显著差异(P>0.05)。实验期间,hLF剂量组大鼠血常规(RBC, WBC, HGB, MCH)、血生化(AST, ALT, GLU)、脏器系数(胸腺/体,肾脏/体,肝脏/体)、骨密度的部分指标与对照组存在显著差异(P<0.05),但各项指标基本在文献报道的正常范围内。各组的血钙浓度没有显著差异,病理学检查未发现明显异常。营养学评价结果显示,hLF剂量组大鼠在血常规(RBC、HGB、MCH)、血生化(TP、ALP、BUN、CHO、HDLC)、骨密度的个别指标上与两个对照组具有显著差异(P<0.05)。在蛋白质功效比值(PER)上,hLF高剂量组与酪蛋白对照组没有差异(P>0.05),但显著高于PR组(P<0.05); hLF中剂量组显著高于其他三组(P<0.05)。经校正的PER值依次为PR组1.97,hLF高剂量组2.50,hLF中剂量组2.73。表明转人乳铁蛋白基因水稻比亲本水稻能更好的被机体吸收利用,中剂量的转人乳铁蛋白基因水稻比高剂量更易于被吸收利用。3.豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)蛋白的表达纯化pTWIN2-CpTI融合表达体系经诱导后获得了有活性的CpTI融合蛋白,但表达的融合蛋白经几丁质柱层析及pH值、温度的诱导裂解等不能获得目的蛋白；pPAL7-CpTI融合表达体系经诱导获得了具有活性的CpTI融合蛋白,融合蛋白经亲和层析获得了具有活性、与天然蛋白一致的CpTI蛋白,纯度可达90%,产量为1.67mg/L诱导菌液。由于融合表达获得的CpTI蛋白产量较低,我们对CpTI蛋白进行了非融合表达的探索。构建的非融合表达体系经诱导条件及离子交换纯化条件等优化处理后,可以得到纯度达到95%、具胰蛋白酶抑制活性的CpTI蛋白,其产量提高到了15mg/L诱导菌液。CpTI纯化蛋白在活性、分子量及免疫原性等方面与天然CpTI蛋白基本一致。小结1.转高赖氨酸基因水稻的食用安全性评价经过对转高赖氨酸基因水稻(GT3、HL5)的营养成分分析、主要营养素的体内消化代谢及亚慢毒性等安全性评价研究,表明转高赖氨酸基因水稻与亲本水稻在主要营养成分上没有显著差异,其不影响动物正常的生长发育代谢。亚慢毒性评价未发现转高赖氨酸基因水稻对健康具有毒副作用。HL5水稻的AAS和PDCAAS评分略高于亲本水稻,提示该转基因水稻蛋白质的质量可能稍高于亲本水稻。动物实验中,虽然个别指标在组间存在统计学差异,但大多数指标数值的差异并不大,且各项指标基本符合文献报道的正常范围。病理检查也未发现具有显著差异的病变。本研究的安全性评价未发现转高赖氨酸基因水稻对健康的副作用。2.转人乳铁蛋白基因水稻的食用安全性评价转人乳铁蛋白基因(hLF)水稻与亲本水稻在主要营养成分上没有显著差异,主要营养素在动物体内的消化代谢与亲本水稻也没有显著差异,不影响动物正常的生长发育代谢。亚慢毒性评价未发现任何对健康不利的毒副作用。hLF剂量组的PER值显著高于亲本大米组,且其PDCAAS评分略高于亲本大米,说明hLF大米更容易被机体吸收利用,其蛋白质的质量可能稍高于亲本大米。动物实验中,虽然个别指标在组间存在统计学差异,但各项指标基本在文献报道的正常范围内。病理检查也未发现具有显著差异的病变。本研究的安全性评价未发现转人乳铁蛋白基因水稻对健康有副作用。营养学评价提示hLF水稻中蛋白质的质量稍高于亲本水稻。3.豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)蛋白的表达纯化本研究对转豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)水稻的外源蛋白表达和纯化进行了研究、摸索,通过对表达方式、诱导表达条件及纯化方式的探索、优化,建立了采用原核表达系统获得具有活性的CpTI蛋白的方法,表达的蛋白纯度达到95%以上,产量为15mg/L菌液,该方法操作简单、目的蛋白损失少且易于扩大生产,为进一步对外源CpTI蛋白的毒性、致敏性等评价研究奠定了基础。