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研究背景:OVO基因是参与细胞特定分化所必须的一类基因,其家族成员在多条参与调节早期和晚期胚胎发育过程的信号通路下游发挥着重要作用。同时,OVO基因也作为转录因子在组织发育中参与调控基因的表达。在哺乳动物中对于OVO基因的研究主要集中在OVOL1和OVOL2基因上。但有关于OVOL1和OVOL2在DNA损伤修复和雄性减数分裂中的作用尚未见报道。研究目的:本项研究旨在明确OVOL1和OVOL2在DNA损伤修复和雄性减数分裂中的作用以及调控机制。研究方法:本项研究通过生物信息学方法分析OVOL1和OVOL2结构信息,然后构建OVOL1和OVOL2缺失表达的小鼠胚胎干细胞,利用荧光定量PCR,串联亲和纯化,免疫印迹,免疫荧光,流式细胞术,基因突变等生物化学与分子生物学相关技术研究OVOL1和OVOL2在DNA损伤修复中的作用,并使用Stra8-GFPCre工具鼠,特异性地在生殖细胞中敲除Ovol1和Ovol2基因,研究OVOL1和OVOL2在雄性减数分裂中的作用。主要研究结果:1.生物信息学分析表明人与小鼠的OVOL1和OVOL2高度同源,同源性分别为96%和88%。无论人源还是鼠源的OVOL1和OVOL2均有4个锌指结构组成的结构域,都有DNA结合和调控基因转录的功能。2.成功构建了基因敲除小鼠分别获得了OVOL1和OVOL2的单独敲除小鼠胚胎干细胞,以及OVOL1和OVOL2双敲除小鼠胚胎干细胞。使用Stra8-GFPCre工具鼠,特异性地在生殖细胞中敲除Ovol1和Ovol2基因。3.在He La细胞中用Laser诱导DNA损伤后,OVOL1和OVOL2都能聚集在DNA损伤位点。通过串联亲和纯化试验发现OVOL1和OVOL2能够与参与DNA损伤修复的蛋白RPA复合体结合,用免疫共沉淀检测点突变的OVOL1和OVOL2发现,它们都是通过靠近C端的三个锌指结构域和RPA复合体结合。4.通过免疫印迹实验发现,小鼠胚胎干细胞中缺失OVOL1或OVOL2后并不会影响RPA复合体与染色体的结合能力,免疫荧光实验发现缺失OVOL1或OVOL2也不影响RPA在DNA损伤位点附近聚集。之后的免疫印迹实验显示,缺失了OVOL1或OVOL2后小鼠胚胎干细胞中CHK1的磷酸化受到影响,并通过流式细胞术分析发现缺失了OVOL1或OVOL2后不能有效激活G2/M细胞周期检查点,细胞DNA损伤修复过程发生延迟,最终造成染色体异常。5.OVOL1或OVOL2缺失的雄性小鼠能够正常生育,其附睾中有成熟精子产生,其睾丸大小和重量与对照组相比没有明显差异,且雄性小鼠生殖细胞减数分裂进程未发现异常。结论:缺失OVOL1或OVOL2会造成小鼠胚胎干细胞中DNA损伤修复的缺陷。OVOL1和OVOL2通过与RPA的结合参与细胞DNA损伤修复过程,并在维持小鼠胚胎干细胞的基因组稳定性中起重要作用。OVOL1或OVOL2的缺失不会影响小鼠的精子发生和减数分裂进程。